[发明专利]一种基于Miseq测序平台的16SrDNA V3-V4区测序引物组合在审
| 申请号： | 201910826845.9 | 申请日： | 2019-09-03 |
| 公开（公告）号： | CN110747264A | 公开（公告）日： | 2020-02-04 |
| 发明（设计）人： | 张鸿;张慧;孙勇 | 申请（专利权）人： | 张鸿 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869;C12N15/11 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 238014 安徽省巢湖市巢湖经济开发区龙泉路*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种基于Miseq测序平台的16SrDNA V3‑V4区测序引物组合，具体涉及高通量测序领域，所述具体步骤如下：引物设计、引物验证、扩增子文库构建、Miseq PE300测序和数据质量产量对比分析。本发明通过设计随机不等碱基差异序列组合和i5‑index、i7‑index最优index组合，实现phix碱基平衡文库添加比例由30％减少到10％，适用于16S rDNA V3‑V4区域的测序引物组合，实现了提高测序质量、减少phix碱基平衡文库添加比例，提高测序数据产量的目的。 | ||
| 搜索关键词： | 测序引物 测序 碱基 文库 高通量测序 扩增子文库 测序平台 测序数据 产量对比 碱基差异 序列组合 引物设计 引物验证 构建 平衡 分析 | ||
【主权项】：
1.一种基于Miseq测序平台的16SrDNA V3-V4区测序引物组合，其特征在于：所述具体步骤如下；/na)引物设计：/n①设计适用于16SrDNA V3-V4区(扩增引物组合341F&806R)的1～7bp不等碱基差异序列组合设计：确保测序过程中，每个cycle A/T/C/G 4种碱基分布均匀；/n②设计i5-index和i7-index最优index组合：确保测序过程中，8bp index测序的8个cycle中A/T/C/G 4种碱基分布均匀；/nb)引物验证：使用设计好的引物进行常规PCR扩增后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过胶图判定设计的引物是否合格，无引物二聚体污染。/nc)扩增子文库构建：/n①PCR产物建库方法：通过内外两组扩增引物经过两步扩增完成文库构建工作；内引物扩增16SrDNA V3-V4区，外引物携带测序Adapter序列；/n②融合引物建库方法：将16SrDNA V3-V4区扩增引物序列与illumina测序Adapter序列融合成一组较长的引物，通过一步扩增完成文库构建工作；/nd)Miseq PE300测序：测序策略：PE 301+8+8+301；Miseq测序过程中，AC共用红激光，GT共用绿激光，只有测序过程每个Cycle中A/T/C/G 4种碱基分布均衡，才能保证最优测序质量和数据产量；/ne)数据质量产量对比分析：/n①对比使用普通差异序列组合和本专利最优差异序列组合的Miseq下机数据质量和产量差异；/n②对比普通i5-index、i7-index组合和本专利设计的最优i5-index、i7-index组合的Miseq下机数据中index数据质量Q30％差异。/n
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