[发明专利]Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法

摘要

本发明提供一种Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及提取方法，主要包括以下步骤：(1)表达和纯化Annexin V，制备Annexin V‑FITC，构建Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠；(2)细胞培养上清液分离与浓缩：细胞培养后分离出细胞培养上清液，并经浓缩处理；(3)外泌体提取：将步骤(2)所得细胞培养上清液与外泌体捕获亲和磁珠共孵育，得到亲和磁珠‑外泌体复合物；(4)外泌体洗脱，将得到的亲和磁珠‑外泌体复合物与洗脱液共孵育，收集洗脱液，即为所提取分离的外泌体产物。本发明所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

主权项

1.制备Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1-1：Annexin V原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-Annexin V质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-Annexin V菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；/n步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；/n步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，再用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集并检测得到含有目的蛋白的洗脱液，使用10KDa超滤管进行浓缩，即得Annexin V浓缩液；/n步骤1-4：将Annexin V浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM的NaHCO₃溶液或50-120mM的Na₂HPO₃溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到Annexin V透析液；/n步骤1-5：将步骤1-4得到的Annexin V透析液稀释为0.5-5mg/mL，并将稀释后的Annexin V透析液与0.5-5mg/mL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h得到混合液；/n步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液加入到3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，并在PBS缓冲液中2-15℃过夜搅拌透析；/n步骤1-7：收集步骤1-6透析后得到的Annexin V-FITC溶液，使用Mono Q离子交换柱进行纯化得到Annexin V-FITC复合物；/n步骤1-8：亲和磁珠制备：将抗FITC抗体磁珠与步骤1-7得到的Annexin V-FITC复合物混合，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h，即得到外泌体捕获亲和磁珠。/n