[发明专利]Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法

权利要求书

1.利用Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤3-1：外泌体提取：于生物体液中加入外泌体结合增强剂和Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠，混合均匀后，4℃、50rpm旋转孵育2h；

步骤3-2：清洗：将步骤3-1旋转孵育后的混合液置于磁力架上1min，弃上清液，然后再将亲和磁珠分散于洗涤缓冲液内混匀，再将混匀后的混合液置于磁力架上1min，弃上清液，由此得到清洗后的亲和磁珠-外泌体复合物；

步骤3-3：外泌体洗脱：于步骤3-2所得亲和磁珠-外泌体复合物中加入洗脱缓冲液，孵育5min后，置于磁力架上1min，收集上清液，该上清液即为所提取分离的外泌体产物；

步骤3-1中，所述外泌体结合增强剂为CaSO₄浓度为2mM-150mM的CaSO₄水溶液；

步骤3-2中，所述洗涤缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM-150mM CaSO₄，10-100mM NaH₂PO₄和50-500mM NaCl，且所述洗涤缓冲液中还含有重量百分比为0.01-0.1％的吐温20；

步骤3-3中，所述洗脱缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM-150mM EDTA，10-100mM NaH₂PO₄和50-500mM NaCl；

所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的制备方法，包括以下步骤：

步骤1-1：Annexin V原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-Annexin V质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-Annexin V菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；

步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；

步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，再用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集并检测得到含有目的蛋白的洗脱液，使用10KDa超滤管进行浓缩，即得Annexin V浓缩液；

步骤1-4：将Annexin V浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM的NaHCO₃溶液或50-120mM的Na₂HPO₃溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到Annexin V透析液；

步骤1-5：将步骤1-4得到的Annexin V透析液稀释为0.5-5mg/mL，并将稀释后的Annexin V透析液与0.5-5mg/mL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h得到混合液；

步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液加入到3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，并在PBS缓冲液中2-15℃过夜搅拌透析；

步骤1-7：收集步骤1-6透析后得到的Annexin V-FITC溶液，使用Mono Q离子交换柱进行纯化得到Annexin V-FITC复合物；

步骤1-8：亲和磁珠制备：将抗FITC抗体磁珠与步骤1-7得到的Annexin V-FITC复合物混合，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h，即得到外泌体捕获亲和磁珠；

所述抗FITC抗体磁珠为超顺磁四氧化三铁磁珠。

2.根据权利要求1所述利用所述Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，当所述生物体液采用细胞培养上清液时，所述细胞培养上清液通过以下方法处理得到：

步骤2-1：细胞培养：细胞培养48h后换成无血清培养基，继续培养36h后收集上清液，记为细胞培养液；

步骤2-2：低速离心：将步骤2-1中收集的细胞培养液进行4℃，4000g离心20-60min，收集上清液，记为一次上清液；

步骤2-3：高速离心：将步骤2-2中收集的一次上清液进行4℃，10000g离心20-60min，收集上清液，记为二次上清液；

步骤2-4：超滤液制备：将步骤2-3中收集的二次上清液采用100KDa超滤管进行超滤处理，超滤后得到所述细胞培养上清液，用于外泌体提取。