[发明专利]Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法

说明书

本发明提供一种Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及提取方法，主要包括以下步骤：(1)表达和纯化Annexin V，制备Annexin V‑FITC，构建Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠；(2)细胞培养上清液分离与浓缩：细胞培养后分离出细胞培养上清液，并经浓缩处理；(3)外泌体提取：将步骤(2)所得细胞培养上清液与外泌体捕获亲和磁珠共孵育，得到亲和磁珠‑外泌体复合物；(4)外泌体洗脱，将得到的亲和磁珠‑外泌体复合物与洗脱液共孵育，收集洗脱液，即为所提取分离的外泌体产物。本发明所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

技术领域

本发明属于外泌体提取技术领域，具体涉及Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)是通过细胞内多泡体与细胞膜融合产生的纳米级细胞外膜泡，其直径在30～150nm，密度为1.13～1.19g/mL，含有脂质、蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性分子，广泛分布在血清、尿液、唾液和其他生物液体中。外泌体作为细胞间通信和遗传物质的重要转移载体，可通过传递其内容物给受体细胞，从而参与多种生理病理过程。

目前细胞外泌体提取方法主要有超速离心法，蔗糖密度梯度离心法，超滤法，高聚物沉淀法以及免疫磁珠捕获法等，然而这些方法各有利弊。超速离心法是目前文献报道中使用最多且有效的提取的外泌体提取的方法，虽然该方法能够得到纯度较高的外泌体，但是其离心步骤繁琐，费时费力，且需要昂贵的设备。蔗糖密度梯度离心法，高聚物沉淀等方法虽然操作简便，耗时短，但是其纯度无法保障，往往含有大量杂蛋白，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响。免疫磁珠法虽然提取的外泌体较纯，但这种基于抗体结合的方法会难洗脱，对外泌体造成损伤。

发明内容

本发明针对现有技术中外泌体提取存在的诸多不足之处，提供一种Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法，所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

本发明采用如下技术方案：

制备Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，包括以下步骤：

步骤1-1：Annexin V原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-Annexin V质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-Annexin V菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；

步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎 0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；

步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，再用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集并检测得到含有目的蛋白的洗脱液，使用10KDa超滤管进行浓缩，即得Annexin V浓缩液；

步骤1-4：将Annexin V浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM 的NaHCO₃溶液或50-120mM的Na₂HPO₃溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到Annexin V透析液；

步骤1-5：将步骤1-4得到的Annexin V透析液稀释为0.5-5mg/mL，并将稀释后的Annexin V透析液与0.5-5mg/mL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm 旋转孵育2-10h得到混合液；