[发明专利]生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法

摘要

本发明公开了生物发酵降解制备灵芝活性多糖及其分析方法，包括以下步骤：S1：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25‑30℃培养箱中培养5‑7d进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取3‑6mm²大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7‑10d得一级种；按照10％的接种量接入液体培养基中；酵母菌发酵法生物降解灵芝大分子多糖的方法，结合乙醇沉淀获得制备活性低分子量多糖组分的方法，添加的酵母将胞外液中的大分子量的多糖降解为分子量较低的多糖。并确定了灵芝活性多糖组分通过与Dectin‑1受体结合激活NF‑κB途径来增强机体免疫活性的用途。

主权项

1.生物发酵降解制备灵芝活性多糖，其特征在于，包括以下步骤：S1：灵芝液体发酵培养：先将灵芝菌株转接至平板PDA培养基中，在25‑30℃培养箱中培养5‑7d进行活化，待菌丝体长满平板之后，挑取3‑6mm²大小的菌块接入装液量为100mL的250mL摇瓶中进行液体发酵培养7‑10d得一级种；按照10％的接种量接入液体培养基中，培养7‑10d后得二级种子液，再按照10％的接种量接入发酵培养基中，然后放入摇床内，转速控制在100‑200rpm/min，温度为25‑30℃，培养7‑10d，结束发酵；S2：灵芝发酵胞外液的分离：待发酵培养结束后，收集发酵液在6000‑8000r/min转速条件下离心，取上清液进行高压灭菌处理；S3：酵母菌发酵降解：将酵母在平板培养基上进行活化，于26℃培养3d左右，待长满平板之后，挑取4mm²大小的菌块接入250mL摇瓶液体培养基，于150r/min，26℃的摇床上培养3d，按照10％的接种量接入上述灭过菌的灵芝胞外液中培养至24h、72h和120h取样，6000‑8000r/min转速条件下离心分离酵母菌与胞外液；S4：多糖组分的分离制备：分别向灵芝发酵胞外液中和经酵母菌发酵培养的胞外液中加入95％的乙醇，使其终浓度为20％，充分搅拌后置于4℃冰箱中沉淀6‑12h，再经高速离心(8000‑10000r/min)后分离沉淀和上清；S5：在上清液中继续加入乙醇使其终浓度为50％，按照上述步骤分离沉淀和上清，继续往上清中加入乙醇使其终浓度为70％，分离获得沉淀；以上20％、50％和70％乙醇沉淀分别以对应醇沉浓度的乙醇洗涤1‑2次后，收集沉淀，加入蒸馏水充分混匀后加热挥去乙醇，经冷冻干燥得到多糖组分20E(20％乙醇沉淀)、50E(50％乙醇沉淀)和70E(70％乙醇沉淀)组分；S6：多糖的特征分析：随着添加酵母培养时间的增加，多糖总得率有了一定的提升，从不添加酵母时的2.62g/L增加到了2.79g/L(添加酵母培养120h)；S7：多糖活性检测：HEK‑Blue hDectin‑1b细胞传代后在检测培养基中和样品共培养24h后，用QUANTI‑Blue法测定胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平，评价样品通过Dectin‑1途径激活NF‑κB的活性。