[发明专利]外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法

摘要

本发明公开了外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法，具体涉及生物技术领域，包括以下步骤：S1、准备材料和试剂；S2、构建pLVX‑puro‑hTERT重组慢病毒载体；S3、表达hTERT基因重组慢病毒颗粒的获得。本发明通过携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，慢病毒载体能够将目的基因高效整合于宿主基因组，从而实现外源基因长期、稳定的表达，整个慢病毒颗粒获取操作方便，获取的慢病毒颗粒对于后期的感染细胞，使正常体细胞永生化得到保证，可获得稳定增殖的永生化细胞系，并且侵染效率高，稳定性较好。

主权项

1.外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、准备材料和试剂：慢病毒表达载体pLVX-puro、慢病毒包装质粒pMD2.G、包膜蛋白质粒psPAX2、293T细胞株、Rochel反转录试剂盒，Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶、Zero Blunt TOPO PCR平端克隆试剂盒、限制性内切酶、GeneJet PCR纯化、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、RNeasy Mini Kit试剂盒、Effectene Transfection Reagent转染试剂盒、hTERT多克隆抗体；/nS2、构建pLVX-puro-hTERT重组慢病毒载体，具体包括：/nS201、按照RNeasyMiniKit试剂盒操作步骤从人293T细胞中提取总RNA，然后用Rochel反转录试剂盒反转录获得cDNA；/nS202、根据NCBI hTERT基因cDNA序列设计上游引物和下游引物，其中，在上游引物添加了NheI酶切位点及保护碱基，在下游引物添加了EcoRI酶切位点保护碱基；/nS203、参照Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶说明书，Zero Blunt TOPOPCR特异性扩增hTERT基因编码序列；/nS204、扩增后的hTERT基因编码序列使用1％琼脂糖凝胶电泳分析，得到大小约为3.3kb的条带，与pCR^TM-BluntII-TOPO按比例连接，连接产物转化Trans-T1感受态细胞，使用质粒小量提取试剂盒说明抽提质粒，用XhoI酶切鉴定，并进行测序；/nS205、将测序正确的质粒稀释后作为模板，上下引物分别加上酶切位点NheI及EcoRI，GeneJet PCR反应得到目的片段并进行纯化，限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切目的基因及慢病毒表达载体pLVX-puro，切胶回收后按比例连接，用双酶切初步鉴定，将鉴定为阳性的质粒进行测序；/nS3、表达hTERT基因重组慢病毒颗粒的获得，具体包括：/nS301、转染前1d，将293T细胞按一定密度传代于2个60mm培养皿中，24h后待细胞密度达70％-80％时开始转染；/nS302、2个培养皿分别用于转染pLVX-puro-hTERT和空质粒pLVX-puro；按照脂类转染剂Effectene Transfection Reagent转染试剂盒说明书，将载体质粒、慢病毒包装质粒pMD2.G、包膜蛋白质粒psPAX2共转染293T细胞株进行病毒包装，48h后收集病毒；/nS303、将收集后的病毒使用离心机进行离心工作，最后用滤器过滤分装，得到慢病毒颗粒，后于-80℃存储。/n