[发明专利]一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用，该方法利用待测核酸片段互补序列、引物、微球、核酸聚合酶、荧光标记ddNTP、核糖3'‑OH被保护的荧光标记dNTP、核糖3'‑OH被保护的dNTP、核糖3'‑OH去保护剂等，通过微球包被引物的单碱基延长，得到了一系列适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球，将这些测序微球进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，本发明具有简洁、准确及数据易解读等显著优点。本发明所得测序微球能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域，尤其是在肿瘤伴随诊断领域有很好的应用。

主权项

1.一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，其特征是包括以下步骤：/n(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，形成引物包被的微球；/n(2)将引物包被的微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液混合，得混合物，将该混合物分为两份，其中一份混合物中加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，另一份的混合物中加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；/n（3）取上一步加入核糖3'-OH被保护的dNTP进行孵育的微球，洗涤后加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；/n（4）将上一步的微球洗涤，分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶和缓冲液混合，所得混合物中再加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶和缓冲液混合，所得混合物中再加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；/n（5）重复上述（3）和（4）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的n群微球；/n（6）如果利用上述步骤（5）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（2）和（4）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（5）继续制备微球，共得到4×n或3×n或2×n群微球，步骤（5）和（6）中得到的4×n、3×n、2×n或n群微球即为能够实现待测核酸片段测序的末端碱基流式荧光测序微球。/n