[发明专利]一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用，该方法利用待测核酸片段互补序列、引物、微球、核酸聚合酶、荧光标记ddNTP、核糖3'‑OH被保护的荧光标记dNTP、核糖3'‑OH被保护的dNTP、核糖3'‑OH去保护剂等，通过微球包被引物的单碱基延长，得到了一系列适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球，将这些测序微球进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，本发明具有简洁、准确及数据易解读等显著优点。本发明所得测序微球能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域，尤其是在肿瘤伴随诊断领域有很好的应用。

技术领域

本发明涉及一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，尤其涉及一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球的制备方法以及采用该末端碱基流式荧光测序微球检测核酸碱基序列的方法，属于基因测序技术领域。

背景技术

基因组携带了生命个体的全部遗传信息，基因测序不但能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解，而且在指导靶向给药方面也发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后，基因测序技术的发展更加迅猛，在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。目前，核酸测序法已发展至三代，从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年以illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序（next-generation sequencing，NGS），到以SMRT、Nanopore法为代表的第三代测序，这些测序法虽然在不断地提高基因测序的效率和准确性，但仍然存在操作复杂、分辨率低及数据不易解读(如：基因结构重排和重复区域)等问题，制约了其大规模应用。

流式细胞技术是利用流式细胞仪对单个细胞或颗粒进行多参数、快速的定量分析的技术，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是先进的生物传感技术之一。已有常见适用于流式细胞仪的包被引物或探针的微球只能用于已知碱基突变靶点的识别，而不能用于碱基测序。因此发展一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球具有重大价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，该方法能够针对待测核酸序列得到合适的测序微球，该测序微球能够被流式细胞仪进行检测，进而准确识别待测核酸片段的碱基序列。

目前，基因检测在遗传学、产前诊断、及伴随诊断等医学领域中有重要的应用。例如：通过基因检测确定患者特定基因片段是否有突变以及突变位点，能够指导靶向给药，提高肿瘤的治疗效果。而现有流式细胞技术仅能对已知的基因突变靶点进行识别，而不能用于碱基测序。本发明提供了适用于流式细胞仪进行测序的测序微球的制备方法，利用该特定的方法制得的测序微球可用流式细胞仪检测，进而得到具体的核酸碱基序列，通过与野生型碱基序列的对比，可以解读基因突变的信息，对发病机理阐述、患病个体诊治都有重要意义。

本发明的技术方案如下：

一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，形成引物包被的微球；

(2)将引物包被的微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液混合，得混合物，将该混合物分为两份，其中一份混合物中加入荧光标记的ddNTP（dideoxynucleosidetriphosphate，双脱氧核苷三磷酸）或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP（deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸），进行孵育，另一份的混合物中加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；

（3）取上一步加入核糖3'-OH被保护的dNTP进行孵育的微球，洗涤后加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；