[发明专利]一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，包括以下步骤：(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：所述第一载体包括Kop‑Cas9‑nos3’UTR，所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列；(2)gRNA的获得；(3)显微注射：将所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。本发明采用不同的特异性启动子控制cas9基因的表达，同时以重复序列为靶位点可以特异剔除鱼类不同组织或细胞的方法，所举例子能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题。

主权项

1.一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：所述第一载体包括Kop‑Cas9‑nos3’UTR，所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列，其重复100万次以上；(2)gRNA的获得：以gRNA‑plasmid为模板，以gRNA‑F/gRNA‑R为引物，gRNA‑F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA‑R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；进行PCR扩增，以测序验证序列PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA；(3)显微注射：将所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。