[发明专利]一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法

权利要求书

1.一种特异剔除斑马鱼原始生殖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：

所述第一载体为Kop-Cas9-nos3’UTR，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；

所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列，其重复100万次以上；

(2)gRNA的获得：

以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；进行PCR扩增，以测序验证PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA；

(3)显微注射：

将所述Kop-Cas9-nos3’UTR和所述gRNA显微共注射；

所述步骤(1)中，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括如下具体方式：

获取基础载体为pkop:KalTA4载体，所述pkop:KalTA4载体的元件为Kop-KalTA4-nos3’UTR；

用DNA限制性内切酶AscI和BspEI将基因KalTA4从所述pkop:KalTA4载体中切除；

获取Cas9基因，设计引物Cas9-F/Cas9-R：

Cas9-F：5’-ACGGCGCGCCACCATGGCTTCTCCACCTAAG-3’；

Cas9-R：5’-AGTCCGGATCACACCTTTCTCTTCTTCTTAGG-3’；

以Cas9质粒为模板，利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶AscI和BspEI酶切后，利用T4 DNA连接酶与上述切除KalTA4 基因的pkop:KalTA4载体骨架连接，获得Kop-Cas9-nos3’UTR；

所述步骤(2)中，gRNA的获得包括如下具体方式：

通过所述gRNA-plasmid和所述gRNA-F/gRNA-R，首先利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌；

然后挑取5个所述大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，所述质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；

再利用MEGAscript® T7Transcription Kit将构建好的含有靶序列的质粒体外转录，20μl反应体系如下：

10x Reaction Buffer 2μl；

Plasmid DNA 4μl；

T7 Enzyme 2μl；

10mmol/L NTP 1μl；

DEPC water 11μl；

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；

所述步骤(3)中，显微注射体系如下：

Kop-Cas9-nos3’UTR 100ng/μl；

gRNA 30ng/μl；

Phenol-red 0.2μl；

DEPC Water up to 2μl；

将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，不同时间取样检测原始生殖细胞特异表达基因nanos1基因的表达水平和原始生殖细胞的数量变化。