[发明专利]一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，包括以下步骤：(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：所述第一载体包括Kop‑Cas9‑nos3’UTR，所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列；(2)gRNA的获得；(3)显微注射：将所述Kop‑Cas9‑nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。本发明采用不同的特异性启动子控制cas9基因的表达，同时以重复序列为靶位点可以特异剔除鱼类不同组织或细胞的方法，所举例子能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法。

背景技术

生态安全问题是转基因鱼产业化所必需直面和亟待解决的问题。影响转基因鱼生态安全的因素包括两个方面：一是转基因鱼可能形成优势种群；二是转植基因可能通过有性交配在同种或者是异种间发生遗传漂移。因此，控制转基因鱼的生殖力将从根本上解决转基因鱼潜在的生态安全问题，为转基因鱼的产业化提供重要的技术保障。然而，鱼类的生殖细胞由胚胎时期的原始生殖细胞发育而来，如果能够大量获得原始生殖细胞被特异剔除的转基因鱼，将能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题，但是目前还未发现特异剔除鱼类活体组合或细胞的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，采用不同的特异性启动子控制cas9基因的表达，同时以重复序列为靶位点可以特异剔除鱼类不同组织或细胞的方法，所举例子能够从源头上解决转基因鱼的生殖控制问题。

本发明的基础方案：一种特异剔除鱼类活体组织或细胞的方法，包括以下步骤：

(1)质粒载体的构建，所述质粒载体包括第一载体和第二载体：

所述第一载体，包括Kop-Cas9-nos3’UTR，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括Kop启动子和nanos1a基因3’端UTR共同使cas9基因特异表达于原始生殖细胞；

所述第二载体为gRNA载体，确定靶序列为：TGGGTTTCCTCCGGGTGCTCCGG，所述靶序列在斑马鱼基因组中为重复序列，其重复100万次以上；

(2)gRNA的获得：

以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGGTTTCCTCCGGGTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；进行PCR扩增，以测序验证序列PCR产物为模板进行体外转录获得gRNA；

(3)显微注射：

将所述Kop-Cas9-nos3’UTR和所述gRNA显微共注射。

进一步，所述步骤(1)中，所述Kop-Cas9-nos3’UTR的构建包括如下具体方式：

获取基础载体为pkop:KalTA4载体，所述pkop:KalTA4载体的原件为Kop-KalTA4-nos3’UTR；

用DNA限制性内切酶AscI和BspEI将基因KalTA4从所述pkop:KalTA4载体中切除；

获取Cas9基因，设计引物Cas9-F/Cas9-R：

Cas9-F：5’-ACGGCGCGCCACCATGGCTTCTCCACCTAAG-3’；

Cas9-R：5’-AGTCCGGATCACACCTTTCTCTTCTTCTTAGG-3’；