[发明专利]一种基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法

摘要

本发明公开了一种基于衰老相关β‑半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法，体外培养的贴壁细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液清洗，然后加入染色液，置37℃无二氧化碳的培养箱，染色结束后转移全部染色液于离心管中，离心后弃染色液，PBS清洗蓝色产物，然后加入DMSO溶解，离心，取上清并测定溶液在640nm处的吸光度，同种方法建立衰老细胞个数与吸光度之间的标准曲线，测定吸光度后由标准曲线可知试验样的细胞衰老个数。本方法具有重现性高、可靠性高、客观性强、影响因素少和速度快等特点，可以实现对动物及人体衰老细胞的快速定量。

主权项

1.一种基于衰老相关β‑半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：标准曲线的绘制建立细胞衰老个数与其对应的最大吸收波长处的吸光度之间的标准曲线；1a、用两个相同的25cm²的细胞培养瓶同时培养两瓶密度相同的细胞，分别记为Ⅰ和Ⅱ，待细胞完全融合后，从培养箱中取出Ⅰ用于细胞计数，计数结果为x个；用PBS缓冲液清洗细胞Ⅱ2‑3次，无需固定；1b、向1a的细胞Ⅱ所得物中加入衰老细胞染色液5‑8mL，在37℃不含CO₂的培养箱中孵育48‑96h；1c、将1b所得物10000g‑14000g离心2‑10min得到蓝色产物，弃上清液后加入300‑500μL DMSO溶解蓝色产物；待溶解后，10000‑14000g离心2‑10min以确保蓝色产物溶解充分，同时去除细胞碎片等杂质；1d、吸取200μL上清液于96孔板中，在波长200‑1000nm范围内测定样品的吸光度并记录，此吸光度对应的细胞个数为y个；1e、用DMSO稀释1倍所测的200μL上清液并混匀，再取混匀后的200μL在波长200‑1000nm范围内测定样品的吸光度，此吸光度对应的细胞个数为y/2，依次稀释并计数，根据细胞个数和吸光度绘制标准曲线；步骤2：待测物的检测2a、培养容器培养细胞融合至90％以上，从培养箱中取出待测细胞，用PBS缓冲液清洗细胞2‑3次，无需固定；2b、向2a所得物中加入衰老细胞染色液，衰老细胞染色液的加入体积与用此容器培养细胞时加入的培养基的体积相等，在37℃不含CO₂的培养箱中孵育48‑96h；2c、将2b所得物10000g‑14000g离心2‑10min得到蓝色产物，弃上清液后加入DMSO溶解蓝色产物，可蜗旋或加热加快溶解速度；待溶解后，10000‑14000g离心2‑10min以确保蓝色产物溶解充分，同时去除细胞碎片等杂质；2d、吸取200μL上清液于96孔板中，在200‑1000nm波长范围内扫描得到吸收光谱曲线；吸光度与衰老细胞数量成线性相关，通过与标准曲线比对获得衰老细胞的数量。