[发明专利]荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种水体污染物检测方法，特别涉及一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法，属于分子生物学领域。本发明通过检测水生昆虫宜兴宽基蜉线粒体基因nad4L表达水平对吡虫啉的应答反应来进行吡虫啉污染监控的技术，具体实施步骤如下：（1）待检测水样的宜兴宽基蜉的培养；（2）总RNA的提取；（3）凝胶电泳检测；（4）RNA浓度测定；（5）RNA反转成cDNA；（6）标准品构建与标准曲线的制作；（7）基因表达量测定；（8）数据分析。该方法灵敏度高，时效性好，特异性强，操作简单，能快速检测水体是否受吡虫啉污染。

主权项

1.一种荧光定量PCR对吡虫啉水体污染的快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）待检测水样的宜兴宽基蜉的培养利用踢网法采集未受吡虫啉污染水域的宜兴宽基蜉稚虫，进行实验室饲养，建立用于吡虫啉污染研究的实验材料；同时采集待测水样地水样，取宜兴宽基蜉于待测水样中培养24 h；（2）总RNA的提取 对在待测水样中培养24 h后的宜兴宽基蜉进行总RNA的提取；（3）琼脂糖凝胶电泳检测 验证样本总RNA提取成功；（4）RNA总浓度的测定用微量紫外分光光度计经过无RNA酶的去离子水调零之后测定RNA浓度，以及A260/A280；RNA浓度大于60 ng/μL，A260/A280在1.9‑2.2之间，说明浓度测定数据可信，可以进行反转实验；（5）RNA反转为cDNA（6）标准品的构建和标准曲线的制作① 配制PCR反应液将cDNA模板分别用EASY Dilution进行1、10、100、1000、10000倍梯度稀释；PCR反应液配置在冰上进行，20 μL PCR反应液中包含终浓度为1x的SYBR Premix Ex Taq II(2x) (Tli RNaseH Plus),Bulk、0.4 μM PCR Froward Primer和0.4 μM PCR Reverse Primer；② PCR反应将配置好的反应液置于实时荧光定量PCR仪中反应，反应程序为95 ℃预变性30 s，然后进入如下循环：95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s，循环40次；利用电脑进行数据统计，观察溶解曲线以及标准曲线情况；溶解曲线为单峰，标准曲线R²值大于0.980，E值在90‑110之间，说明标准曲线可用；（7）基因表达量测定配制荧光定量PCR反应液，反应程序为95 ℃预变性30 s，然后进入如下循环：95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s，循环40次，计算机统计各样本nad4L基因的相对表达量；（8）数据分析利用SPSS或Excel进行t检验，观察其表达量与未受吡虫啉污染的宜兴宽基蜉是否存在显著性差异，若存在显著性差异，说明水体极有可能受到了吡虫啉污染，若不存在显著性差异，则说明水体未受吡虫啉污染。