[发明专利]一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统

摘要

本发明公开了一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，本发明是以阳离子聚合物POSS‑(CG‑NLS‑G‑TAT)₁₆通过静电作用负载上ZNF580基因形成二元基因复合物，然后通过静电相互作用在二元基因复合物表面包裹上修饰了靶向多肽的酸敏感外壳PLCA‑CAGW，从而制备了兼具电荷翻转和靶向功能的基因递送系统。该基因递送系统能促进特定细胞的摄取，能在弱酸性环境下做出智能响应，加速内涵体逃逸和细胞核摄入，从而提高基因转染效率，实现增强内皮细胞体外血管生成的目的。以解决传统基因递送系统所存在的细胞毒性‑转染效率恶性循环的问题。

主权项

1.一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)星型阳离子聚合物POSS‑(CG‑NLS‑G‑TAT)₁₆的制备：1)取POSS‑(NH₃⁺Cl^‑)₈溶于pH为8‑9的磷酸盐缓冲溶液中得到溶液一；取二烯丙基氨基甲酰氯溶于无水氯仿中，得到溶液二；将溶液一冷却至0‑4℃，在搅拌条件下，将溶液二滴加到溶液一中，保持反应液的pH在8‑9，再在室温下搅拌12‑15h，分离得到有机相，洗涤有机相，干燥，过滤，真空干燥得到粗产品，纯化，得到POSS‑(DA)₈；所述POSS‑(NH₃⁺Cl^‑)₈和二烯丙基氨基甲酰氯的质量比为1:(5‑7)；2)按质量比为2:(0.5‑1):(46‑65)的比例，取POSS‑(DA)₈、光引发剂安息香二甲醚和TAT‑G‑NLS‑GC溶于体积浓度为50‑75％的四氢呋喃水溶液中，紫外光光照10‑15min，置于截留分子量3500‑5000Da的透析袋中，在蒸馏水中透析24‑48h，冷冻干燥，得到多肽功能化的星型阳离子聚合物POSS‑(CG‑NLS‑G‑TAT)₁₆；POSS为笼状倍半硅氧烷的缩写；POSS‑(NH₃⁺Cl^‑)₈为八氨丙基笼状倍半硅氧烷盐酸盐的缩写；POSS‑(DA)₈为二烯丙基官能化的笼状倍半硅氧烷缩写；TAT‑G‑NLS‑GC的氨基酸序列：Tyr‑Gly‑Arg‑Lys‑Lys‑Arg‑Arg‑Gln‑Arg‑Arg‑Arg‑Gly‑Pro‑Lys‑Lys‑Lys‑Arg‑Lys‑Val‑Gly‑Cys；(2)电荷翻转和靶向功能外层的制备：取数均分子量为4200Da的ε‑PLL溶于去离子水中得到ε‑PLL水溶液，取双官能的偶联剂溶于甲醇中得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε‑PLL水溶液中，所述ε‑PLL和双官能偶联剂的质量比为20:(6‑12)，在黑暗条件下搅拌4‑6h，加入双官能偶联剂质量(2‑3)倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌6‑10h；调节pH＝8‑9，降温至0‑4℃，加入顺式乌头酸酐，所述ε‑PLL与顺式乌头酸酐的质量比为2:(5‑7.5)，搅拌12‑15h，置于截留分子量为1000‑2000Da的透析袋中，用pH为8‑9的蒸馏水透析24‑48h，冷冻干燥，得到PLCA‑CAGW粉末；即电荷翻转和靶向功能外层；ε‑PLL是ε‑聚赖氨酸的缩写；双官能的偶联剂为3‑(2‑吡啶二巯基)丙酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯；靶向多肽CAGW的氨基酸序列为：Cys‑Ala‑Gly‑Trp；CA是顺式乌头酸酐的缩写；(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：取POSS‑(CG‑NLS‑G‑TAT)₁₆溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与目的基因混匀，室温下静置20‑30min，得到二元基因复合物溶液；取PLCA‑CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA‑CAGW溶液，将PLCA‑CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置20‑30min，POSS‑(CG‑NLS‑G‑TAT)₁₆、目的基因与PLCA‑CAGW的质量比为5：1：(0.5‑5)，得到兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。