[发明专利]一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法

摘要

本发明提供一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，属于生物工程技术领域，将黑色素瘤细胞培养后进行破碎，以200ug/次皮下免疫羊驼四次；第四次免疫1周后采集羊驼抗凝血液，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模版，用第一对引物进行PCR扩增，回收700bp的扩增产物；以700bp扩增产物为模版，第二对引物PCR扩增VHH片段，回收后与pCANTAB5e分别经SfiI两次酶切后连接；将得到的连接产物电转化到TG1感受态细胞，得到黑素瘤纳米抗体库。采用本发明的构建方法构建得到的黑素瘤纳米抗体库，是一个特性很好的免疫文库，适用于特异性地筛选与黑素瘤生长、发育、迁移、增殖等相关的纳米抗体。

主权项

1.一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)黑色素瘤细胞B16培养到80％丰度，破碎细胞，得到抗原共合物；2)将步骤1)得到的抗原共和物与佐剂按体积比为1:1进行配制，将得到的配制物乳化后按200ug/次分点皮下免疫羊驼四次，每次间隔两周，第一次免疫时，所述佐剂为完全弗氏佐剂，第二至第四次免疫时，所述佐剂为不完全弗氏佐剂；3)第4次免疫后1周采集50ml羊驼抗凝血液，分离得到淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，将所述RNA反转录为cDNA；4)以步骤3)得到的cDNA为模版，用Call001‑F和Call002‑R引物进行第一轮PCR扩增，分离纯化700bp的扩增产物；所述Call001‑F引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述Call002‑R引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；5)以步骤4)得到的700bp的扩增产物为模版，用VHH2‑F和VHH2‑R引物PCR扩增VHH片段，分离纯化VHH片段；所述VHH2‑F引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述VHH2‑R引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；6)将步骤5)得到的VHH片段和pCANTAB5e分别用SfiI酶进行两次酶切，连接酶连接，构建得到pCANTAB5e‑VHH重组表达载体；7)将pCANTAB5e‑VHH重组表达载体电转化到TG1感受态细胞，得到黑素瘤纳米抗体库。