[发明专利]一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法

说明书

本发明提供一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，属于生物工程技术领域，将黑色素瘤细胞培养后进行破碎，以200ug/次皮下免疫羊驼四次；第四次免疫1周后采集羊驼抗凝血液，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模版，用第一对引物进行PCR扩增，回收700bp的扩增产物；以700bp扩增产物为模版，第二对引物PCR扩增VHH片段，回收后与pCANTAB5e分别经SfiI两次酶切后连接；将得到的连接产物电转化到TG1感受态细胞，得到黑素瘤纳米抗体库。采用本发明的构建方法构建得到的黑素瘤纳米抗体库，是一个特性很好的免疫文库，适用于特异性地筛选与黑素瘤生长、发育、迁移、增殖等相关的纳米抗体。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法。

背景技术

传统单克隆抗体分子量大，在临床诊疗过程中无法穿透动物机体内的血脑屏障、血睾屏障等保护性组织，大大限制了传统抗体在特定诊断和治疗领域的应用。

羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链但仍具有活性的重链抗体。体外表达该抗体的抗原结合区(VHH)发现仍然具有生物学功能，可以与特定抗原识别。与传统抗体相比，VHH抗体具有以下几个方面的优势：

1、分子量小，可穿透血脑等生物屏障；

2、易进行筛选分析，可在原核或真核系统高效表达；

3、特异性强且亲和力高；

4、免疫原性弱，临床使用时副作用小；

5、稳定性强，易运输和保存。

同时因为纳米抗体的分子量小，具有更多工程学改造的空间，为改善抗体的功能特征(如稳定性、亲和性、特异性和体积大小等)和药代动力学属性等更多应用方向提供了无限潜能。纳米抗体库为筛选特异性纳米抗体提供材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，采用本发明的方法构建得到的黑素瘤纳米抗体库是一个特性很好的免疫文库，适用于特异性地筛选与黑素瘤生长、发育、迁移、增殖等相关的纳米抗体，大大节省了免疫成本和羊驼资源。

本发明提供了一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，包括以下步骤：

1)黑色素瘤细胞B16培养到80％丰度，破碎细胞后，作为抗原共合物；

2)将所述步骤1)得到的抗原共和物与佐剂按1:1进行配制，将得到的配制物乳化后以200ug/次分点皮下免疫羊驼四次，每次间隔两周，第一次免疫时，所述佐剂为完全弗氏佐剂，第二至第四免疫时，所述佐剂为不完全弗氏佐剂；

3)第四次免疫后1周采集50ml羊驼抗凝血液，分离得到淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，将所述RNA反转录为cDNA；

4)以所述步骤3)得到的cDNA为模版，用Call001-F和Call002-R引物进行第一轮PCR扩增，分离纯化700bp的扩增产物；

所述Call001-F引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述Call002-R引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

5)以步骤4)得到的700bp的扩增产物为模版，用VHH2-F和VHH2-R引物PCR扩增VHH片段，分离纯化VHH片段；

所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

所述VHH2-R引物具有SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列；

6)将所述步骤5)得到的VHH片段和pCANTAB5e分别用SfiI酶进行两次酶切，连接酶连接，构建得到pCANTAB5e-VHH重组表达载体；