[发明专利]一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法

权利要求书

1.一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)黑色素瘤细胞B16培养到80％丰度，破碎细胞，得到抗原共合物；

2)将步骤1)得到的抗原共和物与佐剂按体积比为1:1进行配制，将得到的配制物乳化后按200ug/次分点皮下免疫羊驼四次，每次间隔两周，第一次免疫时，所述佐剂为完全弗氏佐剂，第二至第四次免疫时，所述佐剂为不完全弗氏佐剂；

3)第4次免疫后1周采集50ml羊驼抗凝血液，分离得到淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，将所述RNA反转录为cDNA；

4)以步骤3)得到的cDNA为模版，用Call001-F和Call002-R引物进行第一轮PCR扩增，分离纯化700bp的扩增产物；

所述Call001-F引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述Call002-R引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

5)以步骤4)得到的700bp的扩增产物为模版，用VHH2-F和VHH2-R引物PCR扩增VHH片段，分离纯化VHH片段；

所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

6)将步骤5)得到的VHH片段和pCANTAB5e分别用SfiI酶进行两次酶切，连接酶连接，构建得到pCANTAB5e-VHH重组表达载体；

7)将pCANTAB5e-VHH重组表达载体电转化到TG1感受态细胞，得到黑素瘤纳米抗体库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)培养使用的培养基为含有体积分数为8～12％FBS的DMEM高糖培养基。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)反转录包括：将5μg总RNA、1μl Random6 Primer、1μl Oligo(dT)₁₈ Primer、1μl dNTP Mix和7μl ddH₂O混合后在65℃下处理5min，将得到的处理物在冰上静置5min，将所述静置物与4μl 5X PrimeScript IIbuffer、0.5μl RNase inhibiter、1μl Primer Scrip II Reverse Transcriptase和4.5μlddH₂O混合后，依次40℃处理40min和70℃处理15min，得到cDNA。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)第一PCR扩增的体系每50μl包括：2μl cDNA、浓度为10umol/μl的Call001-F 1μl、浓度为10umol/ul的Call001-R 1μl、25μl Taq Green PCR Mix和21μl ddH₂O。

5.根据权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)第一轮PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)PCR扩增VHH片段的体系每50μl包括：浓度为800μg/μl的700bp扩增产物6μl、浓度为10μmol/ul的VHH2-F 2μl、浓度为10μmol/ul的VHH2-R 2μl、Taq GreenPCRMix 25μl和ddH₂O 15μl。

7.根据权利要求1或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)PCR扩增VHH片段的程序包括：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤6)连接的体系每200μl包括：VHH片段1μg、pCANTAB5e载体3μg、T4 DNA Ligase 10μl、10×Buffer 20μl，ddH₂O补充至200μl。

9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤7)电转化包括：所述电转化的电压为1.5～2.0KV，所述电转化的电阻为180～220Ω，所述电转化的电容为20～30μF，所述电转化的时间为4～6ms。