[发明专利]一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法

摘要

本发明公开了一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，属于生物基因工程，本发明以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，通过设计sgRNA中基因特异性序列，获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列，扩增U6‑sgRNA表达组件，合成U6‑sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，最后进行重叠PCR获得完整的U6‑sgRNA表达组件的双链DNA片段的步骤完成构建，整个构建方法基因编辑的成功率，不仅方便且成本低。

主权项

1.一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列与含有U6启动子序列的sgRNA表达组件模板进行连接，得到U6‑sgRNA组件；3)扩增U6‑sgRNA表达组件：通过分子生物学手段获得的含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6‑sgRNA‑X组件连入pGEM‑T载体，得质粒pGEM‑T/U6‑sgRNA‑X，且序列为SEQ ID NO.7；4)合成U6‑sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；F1：5’‑GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG‑3’；F2：5’‑AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG‑3’；F3：5’‑AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA‑3’；F4：5’‑GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG‑3’；5)进行重叠PCR获得完整的U6‑sgRNA表达组件的双链DNA片段。