[发明专利]一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法有效
| 申请号： | 201811558044.0 | 申请日： | 2018-12-19 |
| 公开（公告）号： | CN109609631B | 公开（公告）日： | 2020-01-24 |
| 发明（设计）人： | 许嘉森;吴诗扬;刘志明;朱蓉 | 申请（专利权）人： | 益善生物技术股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12Q1/6841;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 44416 广州科沃园专利代理有限公司 | 代理人： | 徐翔 |
| 地址： | 510663 广东省广州市高新技术产业开*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。本发明提供的方法使用BAC克隆、酶切打断以及不对称扩增等方法制备探针文库，使得产品灵敏度、特异性以及信号强度均得到有效提高。 | ||
| 搜索关键词： | 制备 探针 生物化学领域 生物化学 方法使用 检测领域 探针文库 不对称 灵敏度 扩增 酶切 打断 | ||
【主权项】：
1.一种TOP2A基因的FISH探针文库的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：/n(1)制备得到探针1；/n(2)酶切打断步骤(1)获得的探针1，得到探针2；/n(3)给步骤(2)获得的探针2添加接头，得到探针3；/n(4)对步骤(3)获得的探针3进行不对称扩增，得到FISH探针文库；/n所述的步骤(1)中的探针1为探针1A和探针1B；/n所述的探针1A为针对TOP2A的基因的一条探针；/n所述的探针1B为针对人类17号染色体着丝粒区域的一条探针；/n所述的探针1A为1ng/μL的BAC克隆RP11-885J9；/n所述的探针1B为1ng/μL的BAC克隆RP11-25J2；/n所述步骤(2)中酶切打断所使用的酶为限制性内切酶混合液，所述的限制性内切酶混合液包括10000U/mLAluI、5000U/mLHpyCH4V、10000U/mLMluCI和10000U/mLBfaI，其体积比为1:2:0.5:0.4；/n所述的步骤(3)中添加接头的方法为：通过T4 DNA连接酶将探针2和接头序列连接；/n所述的接头序列为A1接头和A2接头，其中A2接头5’端第一个碱基C含有磷酸化修饰：/n所述的A1接头的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列：/n5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；/n所述的A2接头的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列：/n5’-CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA-3’；/n所述的步骤(4)中不对称扩增的体系包括：dNTP、aminoallyl-dUTP、Epimark HotstratTaq DNA polymerase、引物和探针3；/n所述的引物为：/n正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列：/n5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；/n负向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列：/n5’-TCGGAGACACTCAGAGATGTGATGG-3’；/n所述的dNTP和aminoallyl-dUTP的摩尔比为4:1；/n所述的dNTP中的dTTP和aminoallyl-dUTP的摩尔比为1:4；/n所述的正向引物和负向引物的浓度分别为1μM和20μM。/n
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