[发明专利]类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT-PCR检测标准曲线的建立方法

摘要

本发明涉及医疗技术领域，公开了类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT‑PCR检测标准曲线的建立方法，试验材料包括36只Wistar雌性大鼠、基础日粮、水、牛二型胶原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步骤：试验动物处理后进行引物设计及合成，依次进行RT‑PCR扩增、测序、建立标准曲线以及进行结果分析。本发明以类风湿关节炎(CIA)大鼠为研究对象，通过引物设计、PCR扩增、克隆转化等进行序列测定，并进行Blast比对，说明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平检测方法真实可靠，建立类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT‑PCR检测标准曲线，为后期研究其表达特性提供了准确的试验依据。

主权项

1.类风湿关节炎大鼠炎症因子qRT‑PCR检测标准曲线的建立方法，其特征在于，试验材料包括36只Wistar雌性大鼠、基础日粮、水、牛二型胶原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步骤：S1：试验动物的处理选取36只42±2日龄健康状况良好、Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为3个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，模型CIA组(n＝12)：多点皮下注射牛二型胶原；III组，阳性对照组(n＝12)，造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集3个不同试验组Wistar雌性大鼠脾脏相同部位，放入DEPC水处理过的EP管，迅速置于液氮中保存；S2：引物设计及合成根据NCBI网站提供的参考序列，使用Primer 5.0软件设计4对特异性引物，用于完整CDS区测定，并进行合成；S3：RT‑PCR扩增PCR反应体系：正反向引物各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2×Es Taq Master Mix7.5μL，共15μL；扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min，产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测；S4：测序将回收出来的DNA片段连接至T3‑Cloing‑Vector，PCR仪25℃恒温10min，使连接产物与感受态细胞融合，37℃过夜培养，待LB固体培养基长出蓝白斑，挑取白色单菌落，LB液体培养基培养12‑16h，菌液进行测序；S5：标准曲线的建立将反转录后的CIA大鼠cDNA模板按照10×稀释8个梯度，制备梯度标准品，每个PCR反应体系中起始模板浓度分别是：1.0、10×10‑1、1.0×10‑2、1.0×10‑3、1.0×10‑4、1.0×10‑5、1.0×10‑6、1.0×10‑7，使用ddH2O代替模板，作为阴性对照，荧光定量体系为：SYBR Primix Ex TaqTM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference Dye II 0.4μL，ddH2O 6.0μL，总体积20μL，反应程序：95℃变性10s，95℃ 5s，60℃ 25s，共40个循环；S6：进行结果分析。