[发明专利]具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用

摘要

本发明涉及具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用，属于生物来源杀菌剂和农药加工工艺领域，具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，包括制备发光杆菌发酵液、DHIS的分离与纯化、结构鉴定，并提供了发光杆菌发酵液中DHIS含量分析的方法，以及用于防止由灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病的应用及使用方法。本发明优化了对发光杆菌的发酵条件，大大提高了3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯的产量，本发明制备的DHIS对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果，这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础，在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护，有效防止了由于DHIS在空气中不稳定而导致的防效降低。

主权项

1.具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：包括以下步骤：（1）制备发光杆菌发酵液所述发光杆菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2018年10月10日；保藏编号为：CCTCC NO：M2018664，分类命名为：Photorhabdus temperata subsp. cinerea SN35；所述发光杆菌经NBTA培养基活化，将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得种子发酵液，再转接于改良M发酵培养基中，放置在180 r/min、28 °C的恒温摇床上培养120 h得到发光杆菌发酵液；所述改良M 培养基的配方为：蛋白胨为15‑35 g/L，氯化钠为1‑5 g/L，葡萄糖6.13 g/L，硫酸镁 1.50 g/L，硫酸铵 2.46 g/L，磷酸二氢钾0.86 g/L，磷酸氢二钾 1.11 g/L，硫酸钠 1.72 g/L，亮氨酸3.00 g/L，蒸馏水1 L，pH 值7.2~7.6；（2）DHIS（3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯）的分离与纯化将步骤（1）中得到的发光杆菌发酵液在室温下离心除去菌体，收集上清液，向上清液中加入5%的大孔树脂吸附4 h后将大孔树脂取出放置在30°C 烘箱中充分烘干，烘干后用甲醇浸泡3‑4次，将收集的甲醇液减压浓缩得到发光杆菌的甲醇浸膏，浸膏用甲醇：水 = 1：1的溶液再次溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷相并减压浓缩得到二氯甲烷浸膏；将二氯甲烷浸膏用正相硅胶柱(350 mm × 30 mm i.d.)分离纯化，依次用V (石油醚) ：V (乙酸乙酯) = (100:5、 100:10、100:20、100:30、100:40 和 0:100 ) 梯度洗脱，每个梯度3 L，得到5个组分（A1‑A5）；然后将第三个组分多次经过正相硅胶柱层析，Sephadex LH‑20凝胶柱层析制备得到；（3）DHIS（3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯）的结构鉴定将步骤（2）中得到的物质通过NMR或MS鉴定所得3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯的结构。