[发明专利]利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法在审
| 申请号： | 201811255456.7 | 申请日： | 2018-10-26 |
| 公开（公告）号： | CN109439682A | 公开（公告）日： | 2019-03-08 |
| 发明（设计）人： | 袁慧;田文奇 | 申请（专利权）人： | 苏州博睐恒生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12P19/34 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 215300 江苏省苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法，利用dU修饰引物和古菌DNA聚合酶扩增目标基因和克隆载体，生成5’端为单链DNA尾巴的PCR片段，目标基因和载体PCR片段的单链尾巴彼此配对，不需要任何酶对PCR产物进行处理，简单的混合在一起，就能够形成重组质粒。因此本方法极大地简化了操作步骤，消除了PCR产物处理效率低导致的无缝基因克隆与常规限制性内切酶克隆容易失败的技术缺陷，显著提高了目标基因与质粒间的重组效率，非常便于进行大规模基因克隆。同时，该方法能够应用于基因点突变等，也可用于精准医疗等领域的DNA文库构建。 | ||
| 搜索关键词： | 基因克隆 目标基因 古菌 尾巴 无缝基因克隆 限制性内切酶 处理效率 技术缺陷 克隆载体 修饰引物 重组质粒 单链DNA 点突变 单链 构建 可用 扩增 质粒 配对 克隆 基因 失败 医疗 应用 | ||
【主权项】：
1.一种利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用含有dU碱基的引物扩增目标基因和质粒载体；（2）用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的质粒载体中的环状质粒模板进行消化处理；（3）将步骤（1）得到的扩增后的目标基因与步骤（2）用Dpn I处理后的质粒载体混合并彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。
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