[发明专利]利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法

说明书

本发明公开了一种利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法，利用dU修饰引物和古菌DNA聚合酶扩增目标基因和克隆载体，生成5’端为单链DNA尾巴的PCR片段，目标基因和载体PCR片段的单链尾巴彼此配对，不需要任何酶对PCR产物进行处理，简单的混合在一起，就能够形成重组质粒。因此本方法极大地简化了操作步骤，消除了PCR产物处理效率低导致的无缝基因克隆与常规限制性内切酶克隆容易失败的技术缺陷，显著提高了目标基因与质粒间的重组效率，非常便于进行大规模基因克隆。同时，该方法能够应用于基因点突变等，也可用于精准医疗等领域的DNA文库构建。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆与点突变方法。

背景技术

基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术首先利用限制性核酸内切酶消化目标基因DNA片段与质粒载体，然后DNA连接酶连接环化目标基因与质粒，形成完整的重组质粒。由于限制性核酸内切酶消化反应消化不完全，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。这些方法都依赖于目标基因与质粒载体DNA之间的重组反应，形成环状（带DNA缺口）质粒。然而重组反应效率难于控制，有时候会造成重组反应的失败，最终导致基因克隆失败。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆与点突变方法，能解决现有重组克隆技术的问题，简化了操作步骤，能够显著提高目标基因与质粒载体间的重组效率。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法，包括步骤为：（1）利用含有dU碱基的引物扩增目标基因和质粒载体；（2）用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的质粒载体中的环状质粒模板进行消化处理；（3）将步骤（1）得到的扩增后的目标基因与步骤（2）用Dpn I处理后的质粒载体混合并彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述含有dU碱基的引物的序列为：（a）扩增目标基因的正向引物与扩增质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因的反向引物与扩增质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度为40-50个碱基，3’端下游碱基序列与所述目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基距离5’端10-25个碱基，距离3’端25-35个碱基。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的正向引物、用于扩增质粒载体的正向引物、用于扩增目标基因的反向引物、用于扩增质粒载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述彼此杂交配对过程是在4-50度下放置1-15分钟。

在本发明一个较佳实施例中，所述利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与TaqDNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。