[发明专利]紫杉醇的生产方法在审
| 申请号： | 201811230779.0 | 申请日： | 2018-10-22 |
| 公开（公告）号： | CN109321611A | 公开（公告）日： | 2019-02-12 |
| 发明（设计）人： | 覃家日 | 申请（专利权）人： | 覃家日 |
| 主分类号： | C12P17/02 | 分类号： | C12P17/02;C12N5/04 |
| 代理公司： | 北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙) 11369 | 代理人： | 靳浩 |
| 地址： | 546500 广西壮*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | 本发明提供一种紫杉醇的生产方法，包括以下步骤：1)建立稳定的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，接种红豆杉细胞，人工光照条件下进行通气培养，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养；3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，离心，获得沉淀物，往所述沉淀物中添加去离子水，超声波破碎，离心获得上清液，往所述上清液中添加乙酸乙酯，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；4)对浸膏I进行纯化；5)利用四氢呋喃‑丙酮混合液进行重结晶。本发明具有提取工艺简单、纯度高等特点。 | ||
| 搜索关键词： | 悬浮培养 红豆杉 上清液 紫杉醇 液体悬浮培养基 磷酸缓冲溶液 乙酸乙酯萃取 超声波破碎 干细胞培养 红豆杉细胞 茉莉酸甲酯 内生真菌 去离子水 人工光照 四氢呋喃 通气培养 乙醇溶液 乙酸乙酯 培养基 混合液 培养物 提取物 提取液 重结晶 丙酮 分层 复用 洗涤 接种 生产 | ||
【主权项】：
1.一种紫杉醇的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10‑30分钟后，置于75％酒精中处理10‑30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7‑8天继代一次，经2‑3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种率不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃‑26℃，人工光照条件下进行通气培养6‑8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3‑5次，离心，获得沉淀物，往所述沉淀物中添加去离子水，超声波破碎5‑10min，离心获得上清液，往所述上清液中添加乙酸乙酯，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2‑3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10‑11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43‑46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；5)往所述浸膏II添加四氢呋喃‑丙酮混合液加热溶解，冷切至室温，自然结晶，晶体再次溶解到四氢呋喃‑丙酮混合液进行重结晶2‑3次，获得高纯度的紫杉醇。
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- 2015-12-18 - 2016-04-13 - C12P17/02
- 本发明提供了一种调节红豆杉细胞次级代谢产物的诱导子组合物，该诱导子组合物优选了葡萄糖、肌醇、硫胺素、聚乙烯酰胺、吡哆醇、泛酸钙、钴胺素、天冬氨酸、叶酸、橙皮油等成分并对其用量配比进行了合理化设计，其使用方法是直接添加至细胞培养液中，可以在培养开始阶段添加也可以在细胞进入培养稳定期后添加。实验发现，添加本发明诱导子组合物后虽然不会直接提升细胞培养密度，但是同等生物量的细胞培养液中紫杉醇产率显著提升，这表明本发明诱导子组合物对红豆杉细胞代谢特性产生了一定的影响。本发明以创新性的技术手段实现了突出的技术效果，通过本发明的诱导子组合物有望全面提升紫杉醇的规模化生产现状，带来广阔的应用前景。
- 一种用于红豆杉细胞的液体悬浮培养基-201510973541.7
- 马丹;黄友法 - 天津市博爱生物药业有限公司
- 2015-12-18 - 2016-03-23 - C12P17/02
- 本发明提供了一种用于红豆杉细胞的液体悬浮培养基，该培养基以硝酸钠和磷酸氢二钾分别作为氮源和磷源，并添加了一定的氯化钙，在此基础上意外的发现通过添加特定种类及成分的中药材有助于提升细胞培养密度。基于以上有益的发现，本发明通过实验手段优选了腹水草、独一味、古山龙、广灵香、汉桃叶、知母、陈皮、柿蒂、韭菜子等原本用于人类疾病治疗的中药材成分，所得培养基意外获得了突出的培养效果，使得红豆杉细胞的培养密度得到显著提升，同时其生长速度更快。本发明以创新性的技术手段获得优越的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的应用前景。
- 一种用于红豆杉细胞高密度培养的培养基-201510973465.X
- 夏雪城;马超 - 天津市博爱生物药业有限公司
- 2015-12-18 - 2016-03-23 - C12P17/02
- 本发明提供了一种用于红豆杉细胞高密度培养的培养基，该培养基以硝酸钠和磷酸氢二钾分别作为氮源和磷源，并添加了一定的氯化钙，在此基础上意外的发现通过添加特定种类及成分的中药材有助于提升细胞培养密度。基于以上有益的发现，本发明通过实验手段优选了佛手参、扶桑花、古羊藤、桂皮油、含羞草、山楂、胡荽子、虎头蕉、桦菌芝等原本用于人类疾病治疗的中药材成分，所得培养基意外获得了突出的培养效果，使得红豆杉细胞的培养密度得到显著提升，同时其生长速度更快。本发明以创新性的技术手段获得优越的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的应用前景。
- 一种红豆杉细胞培养基-201510969068.5
- 夏雪城;黄友法 - 天津市博爱生物药业有限公司
- 2015-12-18 - 2016-03-16 - C12P17/02
- 本发明提供了一种红豆杉细胞培养基，该培养基以硝酸钠和磷酸氢二钾分别作为氮源和磷源，并添加了一定的氯化钙，在此基础上意外的发现通过添加特定种类及成分的中药材有助于提升细胞培养密度。基于以上有益的发现，本发明通过实验手段优选了黄蜀葵、火绒草、鸡眼草、剪刀草、腊梅花、苦木、辣蓼草、江南卷柏、瓜子金等原本用于人类疾病治疗的中药材成分，所得培养基意外获得了突出的培养效果，使得红豆杉细胞的培养密度得到显著提升，同时其生长速度更快。本发明以创新性的技术手段获得优越的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的应用前景。
- 一种诱导红豆杉细胞生产多烯紫杉醇半合成前体的培养基添加剂-201510964058.2
- 夏雪城;马丹 - 天津市博爱生物药业有限公司
- 2015-12-18 - 2016-03-09 - C12P17/02
- 本发明提供了一种诱导红豆杉细胞生产多烯紫杉醇半合成前体的培养基添加剂，该添加剂包括噻重氮苯基脲、赤霉素、聚乙烯比咯烷酮、槲皮素、蛋白胨、酵母粉、黄芩、苦楝皮、莨菪子、独定子等成分。本发明通过在培养基中添加诱导子的方式干涉红豆杉细胞自身代谢模式，从而定向诱导红豆杉细胞分泌多烯紫杉醇半合成前体——10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ。实验发现，在细胞培养液中添加本发明添加剂后，红豆杉细胞对10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ的分泌量显著提升，同时能够在一定程度增进细胞培养密度。本发明技术思路清晰，技术方案合理，具有良好的规模化应用前景。
- 一种用于规模化生产紫杉醇的红豆杉细胞培养基-201510960018.0
- 马丹;夏津城 - 天津市博爱生物药业有限公司
- 2015-12-18 - 2016-03-02 - C12P17/02
- 本发明提供了一种用于规模化生产紫杉醇的红豆杉细胞培养基，该培养基以传统自养培养基提供氮源和磷源，并添加了一定的钙离子，在此基础上意外的发现通过添加特定种类及成分的中药材有助于促进紫杉醇的产率。基于以上有益的发现，本发明通过实验手段优选了虫白蜡、八月札、山药、雌黄、凤眼草、杜仲、地黄、蜂蜡、麦冬等原本用于人类疾病治疗的中药材成分，所得培养基意外获得了突出的培养效果，使得红豆杉细胞的紫杉醇产率得到显著提升，同时其生产周期更短。本发明以创新性的技术手段获得优越的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的应用前景。
- 一种诱导红豆杉细胞生产10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ的培养基添加剂-201510960016.1
- 夏雪城;夏爽 - 天津市博爱生物药业有限公司
- 2015-12-18 - 2016-03-02 - C12P17/02
- 本发明提供了一种诱导红豆杉细胞生产10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ的培养基添加剂，该添加剂包括钼酸钠、秋水仙素、组氨酸、芹菜素、蛋白胨、酵母粉、连翘、鸡骨草、扁豆衣、景天三七等成分。本发明通过在培养基中添加诱导子的方式干涉红豆杉细胞自身代谢模式，从而定向诱导红豆杉细胞分泌多烯紫杉醇半合成前体——10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ。实验发现，在细胞培养液中添加本发明添加剂后，红豆杉细胞对10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ的分泌量显著提升，同时能够在一定程度增进细胞培养密度。本发明技术思路清晰，技术方案合理，具有良好的规模化应用前景。
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