[发明专利]一种西瓜倍性检测方法

摘要

本发明公开了一种西瓜倍性检测方法。步骤包括：原生质体制备、总DNA提取、定量PCR法检测DNA浓度。以不同倍性西瓜叶片为材料分离原生质体，提取等量原生质体中的总DNA，根据西瓜5S rDNA序列设计定量PCR特异引物，以不同浓度DNA绘制Ct值与DNA浓度的标准曲线，根据不同倍性西瓜DNA溶液测得Ct值换算其浓度并计算其倍性。本发明对样品要求较低，除营养物质较多的果实、种子之外的其他植物组织均可进行原生质体分离；对仪器设备要求较低，价格低廉的荧光定量PCR仪可满足需求，无需购置价格相对昂贵的流式细胞仪；准确性与流式细胞法相近，检测精度高于气孔保卫细胞叶绿体计数法，操作流程较染色体计数法更容易实现；为西瓜倍性检测提供了新的途径。

主权项

1.一种西瓜倍性检测方法，其步骤为：A、以二倍体西瓜叶片为材料分离原生质体，将叶片切成10mm × 0.1mm细条，置于培养皿中，加入10 ml酶液后置于45 rpm摇床、24°C、遮光条件下反应4‑6小时；反应完成后100g离心收集原生质体，镜检；以未知倍性西瓜叶片为材料分离原生质体，将叶片切成10mm × 0.1mm细条，置于培养皿中，加入10 ml酶液后置于45 rpm摇床、24°C、遮光条件下反应4‑6小时；反应完成后100g离心收集原生质体，镜检；B、通过血球计数板将步骤A中所述的二倍体和未知倍性西瓜原生质体调至相同浓度，分别取等体积原生质体悬浮液提取总DNA；C、以西瓜5S rDNA序列片段为模板设计定量PCR引物；5S rDNA序列片段序列如下：5’‑CGATCATACCAGCACTAATGCACCGGATCCAACCAGAACTCCGCAGTTAAGCGTGCTGGGACGAGAGTAGTACTAAGTTGGGTGACCACTTGGGAAGTCCTCGTGTTGCAC‑3’；引物序列如下：正向引物：5’‑CGATCATACCAGCACTAATGCACC‑3’；反向引物：5’‑CTCAACACGAGGACTTCCCAA‑3’；D、取二倍体西瓜原生质体的DNA溶液进行qPCR检测测定其模板DNA的Ct值；取未知倍性西瓜原生质体的DNA溶液进行qPCR检测测定其模板DNA的Ct值；E、比较二倍体和未知倍性西瓜原生质体中DNA总量，若未知倍性西瓜原生质体的DNA总量与二倍体相同，则未知倍性西瓜为二倍体，若未知倍性西瓜原生质体的DNA总量为二倍体的2倍，则未知倍性西瓜为四倍体。