[发明专利]一种降钙素原抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种降钙素原抗体的制备方法，该方法包括动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的准备、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、杂交瘤细胞的筛选、阳性杂交瘤细胞的亚克隆、大规模制备PCT单抗、PCT抗体的纯化、鉴定单抗特性等步骤，本发明制备方法简单有效，制备的PCT单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，与PCT具有良好的结合能力，可以用于PCT的功能研究，也可以用于开发基于PCT的诊断试剂，为细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控提供帮助。

主权项

1.一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PCT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周，将PCT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ugPCT蛋白不加佐剂尾静脉注射，3d后，小鼠眼球采血，分离血清，保存备用，处死小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中，调整浓度为1×107个/mL；(2)骨髓瘤细胞的准备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞保持在对数生长阶段；(3)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，2000r/min离心5min,弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；50％聚乙二醇PEG4000 1mL，左手匀速转动融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1000rpm/min离心10min，弃上清，加入20mL HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI‑1640完全培养液换液；(4)细胞筛选：细胞长至孔底1/5面积时，对细胞上清液进行ELISA筛选阳性克隆杂交瘤细胞，并扩大培养；(5)亚克隆：采用软琼脂法对筛选的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆2‑4次，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性PCT杂交瘤细胞株，将高特异性PCT杂交瘤细胞株液氮保存；(6)大规模制备单抗：成年BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml,10天后腹腔接种用无血清培养基稀释的PCT单克隆抗体杂交瘤细胞，将细胞数调整至5*105，每只小鼠注射0.2ml,间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，将腹水2000r/min离心5min,收集上清,即得到PCT单克隆抗体；(7)抗体纯化：采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化PCT单克隆抗体；(8)鉴定单抗特性：使用BIO‑RAD公司生产的核酸蛋白测定仪测定浓度，采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定PCT单克隆抗体的亚型。