[发明专利]一种降钙素原抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种降钙素原抗体的制备方法，该方法包括动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的准备、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、杂交瘤细胞的筛选、阳性杂交瘤细胞的亚克隆、大规模制备PCT单抗、PCT抗体的纯化、鉴定单抗特性等步骤，本发明制备方法简单有效，制备的PCT单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，与PCT具有良好的结合能力，可以用于PCT的功能研究，也可以用于开发基于PCT的诊断试剂，为细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控提供帮助。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种降钙素原抗体的制备方法。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是一种糖蛋白质，来自定位于第11号染色体上(11p15，4)的单拷贝基因。PCT是血清降钙素(CT)的前肽物质，PCT前体在内源多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116个氨基酸的PCT，分子量约为13kD。其分子结构为含57个氨基酸的N末端(N-ProCT)、含32个氨基酸CT(Cakitonin)和含21个氨基酸钙抑肽(Katacalcin)组成。在正常生理情况下，PCT是由甲状腺合成与分泌的，其在健康人体的血浆中的含量非常低(小于0.1ng/ml)，但是PCT蛋白在体内的稳定性很好，半衰期大约为20-24h。PCT在人体感染时受内毒素、TNF-α等细胞因子影响在多种组织均可产生，当严重细菌、脓毒症、多脏器功能衰竭时其在血浆中的水平升高，自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。PCT已被认为是一种用于细菌感染早期诊断、鉴别诊断及治疗监控的最新特异性指标。因此，PCT的检测在临床诊断上有着重要的价值。

目前，临床上对于PCT的检测主要采用免疫学的方法，包括胶体金免疫层析、酶免法、免疫荧光法、免疫化学发光、放射免疫分析法等。而采用这些方法最关键的是获得好用的PCT抗体。由于PCT在正常人血清中含量很低(<0.1ng/ml)，临床上的诊断界值一般为0.5ng/ml。因此对诊断用的PCT抗体，除了特异性要好外，对亲和力要求也非常高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降钙素原抗体的制备方法，制备的抗体特异性好，亲和力高，能够用于降钙素原检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种降钙素原抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PCT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周，将PCT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ugPCT蛋白不加佐剂尾静脉注射，3d后，小鼠眼球采血，分离血清，保存备用，处死小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中，调整浓度为1×10⁷个/mL；

(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞保持在对数生长阶段；

(3)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以5:1的比例混合，放入融合管中，2000r/min离心5min,弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；50％聚乙二醇PEG40001mL，左手匀速转动融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1000rpm/min离心10min，弃上清，加入20mL HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO₂的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；