[发明专利]一种降钙素原抗体的制备方法

权利要求书

1.一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PCT蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周，将PCT蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ugPCT蛋白不加佐剂尾静脉注射，3d后，小鼠眼球采血，分离血清，保存备用，处死小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中，调整浓度为1×10⁷个/mL；

(2)骨髓瘤细胞的准备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞保持在对数生长阶段；

(3)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，2000r/min离心5min,弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；50％聚乙二醇PEG4000 1mL，左手匀速转动融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1000rpm/min离心10min，弃上清，加入20mL HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO₂的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；

(4)细胞筛选：细胞长至孔底1/5面积时，对细胞上清液进行ELISA筛选阳性克隆杂交瘤细胞，并扩大培养；

(5)亚克隆：采用软琼脂法对筛选的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆2-4次，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性PCT杂交瘤细胞株，将高特异性PCT杂交瘤细胞株液氮保存；

(6)大规模制备单抗：成年BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml,10天后腹腔接种用无血清培养基稀释的PCT单克隆抗体杂交瘤细胞，将细胞数调整至5*10⁵，每只小鼠注射0.2ml,间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，将腹水2000r/min离心5min,收集上清,即得到PCT单克隆抗体；

(7)抗体纯化：采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化PCT单克隆抗体；

(8)鉴定单抗特性：使用BIO-RAD公司生产的核酸蛋白测定仪测定浓度，采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定PCT单克隆抗体的亚型。

2.如权利要求1所述的一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0细胞。

3.如权利要求1所述的一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为5:1。

4.如权利要求1所述的一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，饲养细胞的制备方法为：细胞融合前4天，通过颈脱位处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，2000r/min离心5min,弃上清，用5ml HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*10⁵个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO₂培养箱中培养备用。

5.如权利要求1所述的一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述纯化后PCT单克隆抗体的纯度为90％。

6.如权利要求1所述的一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，所述PCT杂交瘤细胞株的亚型为IgG1型，轻链为k链。