[发明专利]一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法

摘要

本发明公开了一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，带有部分CGMMV序列的T1和带有Mg2+‑依赖的DNAzyme的部分酶序列的P1杂交，AcⅡ识别其底物序列5′‑AACGTT‑3′，后者被剪切成两部分，随后解链为4个ssDNA片段，加入脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)及dCTP，进行加尾反应，生成Mg2+‑依赖的DNAzyme的完整酶序列。然后再加入HP，HP的环部位与Mg2+‑依赖的DNAzyme的酶序列进行杂交，在Mg2+存在下，Mg2+‑依赖的DNAzyme酶序列剪切其识别位点，将HP的茎环结构剪切为两部分，位于茎部位的G‑四连体结构被释放，在K+存在下，结合Hemin形成Hemin/G‑四连体结构，在H2O2存在下，催化ABTS2‑氧化，使溶液变绿。溶液吸光度与CGMMV浓度呈正相关。

主权项

1.一种基于脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将T1和P1混合在NEB CutSmart缓冲溶液中，在37℃下杂交；(2)加入内切酶AcⅡ，利用AcⅡ识别5′‑AACGTT‑3′位点，在37℃下持续反应一定时间，获得酶切产物，37℃下解链为4个ssDNA片段；(3)取一定量的所述酶切产物，加入TdT和dCTP于磷酸盐缓冲溶液中混合，在37℃下进行加尾反应，升温至85℃灭活3min，获得Mg2+‑依赖的DNAzyme的完整酶序列；(4)加入HP和含Mg2+缓冲液，在37℃下孵育100min，Mg2+‑依赖的DNAzyme的完整酶序列与HP进行杂交，在Mg2+存在下，Mg2+‑依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP剪切为两部分；(5)加入一定浓度的Hemin和含K+缓冲液，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G‑四连体结构溶液；(6)最后依次在Hemin/G‑四连体结构溶液中加入一定浓度的ABTS2‑和H2O2溶液，室温下反应一段时间，得到绿色溶液。