[发明专利]一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用

摘要

一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，包括如下步骤：微生物益生菌培养；微生物益生菌固定化胶球的制备；微生物益生菌耐重金属性检测；微生物益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌为枯草芽孢杆菌CGMCC No.5155、蜡状芽孢杆菌CGMCC No.13007及芽孢杆菌CGMCC No.15612；耐重金属益生菌反向筛选最佳配比。本发明采用反向筛选模型的方法筛选生物菌和修复剂配方，并采用固定化的方法将生物菌及其他成分制备成固定化小球施于重金属污染土壤中，制备的土壤复合修复剂能够显著地降低土壤活性态重金属，并使杂交水稻铅、镉的含量达标。

主权项

1.一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：a、微生物益生菌培养：100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液，将海藻酸钠、黄原胶、重金属污染土壤、黏土矿物、生物炭、腐植酸、肉汤培养基（NB）和植物培养基（MS）按比例加入浸提液中，混合均匀，并加入水稻种子，向混合物中加入质量分数为1‑2%的CaCl2，进行固化，培养7‑10天，长出微生物；将培养的微生物进行分离纯化，筛选得到16种益生菌，剔除溶血实验阳性的10株菌，保藏6株菌；b、微生物益生菌固定化胶球的制备：将100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液；以浸提液分别配置4%的海藻酸钠、肉汤培养基（NB）、马铃薯培养基（PDB）和植物培养基（MS），将各培养基进行等量混合，向混合培养基中按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸；将步骤a培养的微生物益生菌和保藏号为CGMCC No.5155的环状芽孢杆菌一同加入到混合培养基中，同时将以步骤a培养的微生物益生菌进行浸泡露白的拟南芥种子加入混合培养基中，混合均匀，将混合液通过枪头注入到2%的CaCl2溶液中，留置4h，制成固定化胶球；c、微生物益生菌耐重金属性驯化：将步骤b制备的微生物益生菌固定化胶球装入层析柱中，向柱内连续流入0.6mg/kg的镉和256mg/kg的铅，稀释率D为0.1，停留时间为10个循环的时间，测定流出液中镉、铅的含量，并以肉汤培养基、马铃薯培养基分离流出液中的微生物益生菌；然后，逐次增加镉和铅的含量，镉分别由2mg/kg、8mg/kg至16mg/kg、铅分别对应由512mg/kg、1028mg/kg至2048mg/kg，三轮稀释率D仍为0.1，停留时间仍为10个循环的时间，分离流出液中的微生物益生菌；d、耐重金属益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌均为芽孢杆菌，分别为环状芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌和芽孢杆菌，所述环状芽孢杆菌原初分离时成半颗玻璃珠状，经多次诱变驯化后，呈厚的较粘稠状态，仍为圆形，表面粗糙不透明，呈污白色，其保藏号为CGMCC No.5155；所述蜂房类芽孢杆菌呈圆形或近圆形，稍有光泽的白色菌落，其保藏号为CGMCC No.13007；所述芽孢杆菌呈圆形，粗糙类似毛玻璃状，可对重金属进行生物矿化，其保藏号为CGMCC No.15612；e、耐重金属益生菌反向筛选最佳配比：以肉汤培养基融化海藻酸钠，按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸，放至40℃，将步骤d得到的微生物菌株按不同比例加入到培养基中，混匀，利用蠕动泵将混合物滴入2%的CaCl2溶液中，在4℃条件下硬化储藏，制备成土壤修复剂胶球，盆栽试验确定菌株的最佳配比。