[发明专利]一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用

说明书

一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，包括如下步骤：微生物益生菌培养；微生物益生菌固定化胶球的制备；微生物益生菌耐重金属性检测；微生物益生菌检测：将分离出的微生物益生菌进行活性检测，确定强耐重金属的微生物益生菌为枯草芽孢杆菌CGMCC No.5155、蜡状芽孢杆菌CGMCC No.13007及芽孢杆菌CGMCC No.15612；耐重金属益生菌反向筛选最佳配比。本发明采用反向筛选模型的方法筛选生物菌和修复剂配方，并采用固定化的方法将生物菌及其他成分制备成固定化小球施于重金属污染土壤中，制备的土壤复合修复剂能够显著地降低土壤活性态重金属，并使杂交水稻铅、镉的含量达标。

技术领域

本发明涉及污染土壤的再生技术领域，尤其涉及一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用。

背景技术

土壤微生物在土壤生物中占据主导地位。土壤中存在着数目庞大、结构复杂的微生物群落。土壤微生物在与植物共进化过程中形成共生关系，在促进植物生长、防控植物疾病、减少土壤与农作物有机无机污染、调节酸碱度等方面发挥重要作用。

工业益生菌的获得有很多方法，常用方法为：富集分离、纯化—小试规模验证功能—通过毒理试验—扩大试验规模验证功能—获得工程化数据—注册，生产。

相比而言，益生菌在农业上的应用具有更大的难度，原因是农业生态多变、不具有工业那样的人为可控制性，如土壤、土壤中的生物(含植物、微生物与小型动物)皆受到多变的环境影响。因此普遍的现象就是，农用益生菌田间效果不稳定，与实验室的效果相差甚远，导致多数的实验室工作白废。另外，现有技术得到新型有效微生物的机率越来越低，重要的原因是获取微生物的过程中微生物脱离了原生态的物理化学生物环境：模拟环境不可能复制真实环境，如养分浓度过高，活性氧毒害，微生物间的相互作用如共生、互生缺失，等等。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用，采用反向筛选模型的方法筛选生物菌，将离体筛选模型和活体筛选模型相结合，并采用固定化的方法将筛选的生物菌及其他成分固定在小球载体内施于被重金属污染的土壤中，从而显著地降低土壤活性态重金属，并使杂交水稻铅、镉的含量达标。

本发明所述的技术问题是以如下技术方案解决的：

一种模拟微生态的益生菌的筛选方法，包括如下步骤：

a、微生物益生菌培养：100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液，将海藻酸钠、黄原胶、重金属污染土壤、黏土矿物、生物炭、腐植酸、肉汤培养基(NB)和植物培养基(MS)按比例加入浸提液中，混合均匀，并加入水稻种子，向混合物中加入质量分数为1-2％的CaCl₂，进行固化，培养7-10天，长出微生物；将培养的微生物进行分离纯化，筛选得到16种益生菌，剔除溶血实验阳性的10株菌，保藏6株菌；

b、微生物益生菌固定化胶球的制备：将100g重金属污染土壤与灭菌蒸馏水按质量比1：1进行浸提，得到重金属污染土壤浸提液；以浸提液按比例分别配置4％的海藻酸钠、肉汤培养基(NB)、马铃薯培养基(PDB)和植物培养基(MS)，将各培养基进行等量混合，向混合培养基中按比例加入黏土矿物、生物炭和腐植酸；将步骤a培养的微生物益生菌和保藏号为CGMCC No.5155的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)一同加入到混合培养基中，同时将以步骤a培养的微生物益生菌进行浸泡露白的拟南芥种子加入混合培养基中，混合均匀，将混合液通过枪头注入到2％的CaCl₂溶液中，留置4h，制成固定化胶球；