[发明专利]一种检测基因突变的方法、试剂盒及其制备方法

摘要

本发明涉及一种检测基因突变的方法、试剂盒及其制备方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行Index PCR扩增；(4)对PCR扩展产物进行文库质控后，在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；(5)将测序的序列信息进行生物信息学分析得出基因变异数据。本发明还涉及有关的试剂盒。

主权项

1.一种检测基因突变的方法，包括步骤如下：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行Index PCR二次扩增；(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列；将原始模板序列与人类基因组比对，通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯一的模板序列集合；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性；通过计算突变序列与参照序列的比例统计出检测区域体细胞基因突变率；其特征在于：预扩增中采用的引物是多对引物的混合物，所述多对引物用于特异性扩增待测区域中的不同亚目标区域；所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基因中的不同区域的DNA片段。每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；在所述Index PCR二次扩增中，所述二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序接头序列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所述二次扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列B的全部或部分；所述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index序列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一Index序列。