[发明专利]通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用

摘要

本发明旨在提供一种通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方及菌株及其应用，本发明采用基因工程手段通过敲除地衣芽孢杆菌DW2的基因组中的lysE基因构建得到地衣芽孢杆菌DW2ΔlysE，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了10%以上。

主权项

1.通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lysE基因的上游同源臂和lysE基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒 T2(2)‑ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)‑ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)‑ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)‑ori中，得到lysE基因敲除质粒T2(2)‑ori‑ lysE；（5）将lysE基因敲除质粒T2(2)‑ori‑ lysE转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lysE基因的上游臂或lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选lysE基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lysE基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除lysE基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔlysE；其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的lysE基因为SEQUENCE LISTING中所示。