[发明专利]一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201810324763.X | 申请日： | 2018-04-11 |
| 公开（公告）号： | CN108588127A | 公开（公告）日： | 2018-09-28 |
| 发明（设计）人： | 陈远;汪凤麟;蔡洁行;周伟昌;陈智胜 | 申请（专利权）人： | 上海药明生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12N5/10;C12N9/24;A61K38/47;A61P3/00 |
| 代理公司： | 上海浦一知识产权代理有限公司 31211 | 代理人： | 郑权 |
| 地址： | 200131 上海市浦东*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明公开一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株的制备方法，包括以下步骤：(1)脂质体转染：针对GNT1基因的序列，设计引导核酸内切酶切割的sgRNA序列；将所述sgRNA序列重组至敲除载体中，得到sgRNA和核酸内切酶共表达的合成质粒；通过脂质体转染方法将合成质粒转染稳定表达葡萄糖脑苷脂酶的细胞池；(2)有限稀释法克隆：筛选出单克隆细胞进行扩大培养；(3)目的基因突变克隆筛选：通过细胞PCR测序获得GNT1基因敲除单克隆，即得到一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株。该细胞株不仅能稳定表达葡萄糖脑苷脂酶，并且甘露糖糖型含量显著提高，可有效提高其与甘露糖受体结合能力，提高其酶活能力，达到增加药效目的。 | ||
| 搜索关键词： | 葡萄糖脑苷脂酶 细胞株 高甘露糖 核酸内切酶 脂质体转染 稳定表达 合成 制备方法和应用 单克隆细胞 甘露糖受体 基因敲除 结合能力 克隆筛选 扩大培养 目的基因 序列重组 质粒转染 甘露糖 共表达 稀释法 细胞池 酶活 敲除 质粒 制备 突变 切割 克隆 筛选 细胞 基因 | ||
【主权项】：
1.一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)脂质体转染：针对GNT1基因的序列，设计引导核酸内切酶切割的sgRNA序列；将所述sgRNA序列重组至敲除载体中，得到sgRNA和核酸内切酶共表达的合成质粒；通过脂质体转染方法将合成质粒转染稳定表达葡萄糖脑苷脂酶的细胞池；(2)有限稀释法克隆：通过对转染后细胞群进行有限稀释法克隆，筛选出单克隆细胞进行扩大培养；(3)目的基因突变克隆筛选：通过对单克隆细胞进行细胞PCR测序，获得GNT1基因敲除单克隆。
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