[发明专利]一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株的制备方法，包括以下步骤：(1)脂质体转染：针对GNT1基因的序列，设计引导核酸内切酶切割的sgRNA序列；将所述sgRNA序列重组至敲除载体中，得到sgRNA和核酸内切酶共表达的合成质粒；通过脂质体转染方法将合成质粒转染稳定表达葡萄糖脑苷脂酶的细胞池；(2)有限稀释法克隆：筛选出单克隆细胞进行扩大培养；(3)目的基因突变克隆筛选：通过细胞PCR测序获得GNT1基因敲除单克隆，即得到一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株。该细胞株不仅能稳定表达葡萄糖脑苷脂酶，并且甘露糖糖型含量显著提高，可有效提高其与甘露糖受体结合能力，提高其酶活能力，达到增加药效目的。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其是涉及一种采用CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)细胞表达目的蛋白酶以及利用基因编辑技术CRISPR敲除目的基因后改造其产物糖型的方法。

背景技术

溶酶体中每一种酶的缺陷都会导致某一特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积。其共同的结果都是溶酶体随之发生肿胀，细胞也变得臃肿失常，细胞功能受到严重影响，最终导致疾病，称之为溶酶体贮积症(Lysosomal storage disease,LSD)。葡萄糖脑苷脂病，属于LSD的一种，是一种家族性糖脂代谢疾病，是由于葡萄糖脑苷脂酶的缺乏，使大量的葡萄糖脑苷脂在肝、脾、骨骼、肺和脑组织的单核-巨噬细胞中蓄积，最终导致细胞肿胀，损伤或死亡。Brady等在1964年发现葡萄糖脑苷脂的贮积是由β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)-葡萄糖脑苷酯酶(glucerebrosidase，GBA)缺乏所致，为葡萄糖脑苷脂酶缺乏症的诊断和治疗提供了理论依据。

酶替代疗法是现今治疗LSD的最为成熟最主要的治疗方法之一，它是一种医学治疗方法，当患者体内缺失特定的酶时，通常采用此法进行酶替代，一般通过静脉注射向患者体内注射含有缺失酶的药剂，替代缺失的酶。国外近年来采用葡萄糖脑苷脂酶治疗葡萄糖脑苷脂酶缺乏症，取得一定疗效。由于溶酶体内复杂碳水化合物和脂类分解过程不易受外环境因素操纵，因此需要利用溶酶体可通过胞吞作用而相对非选择性摄取外源蛋白的特性，使葡萄糖脑苷脂酶直接进入溶酶体内进行作用。葡萄糖脑苷脂酶与许多溶酶体酶一样具有甘露糖残基，在细胞外可被邻近细胞通过甘露糖受体结合，进入体内各种类型细胞的溶酶体中有效水解溶酶体中沉积的葡萄糖苷脂，纠正脂质代谢紊乱。

但是现有方法所使用的细胞株制备获得葡萄糖脑苷脂酶中甘露糖糖型的含量不高，酶活效力较差，药效不够理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种可表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株及其制备方法，其是利用基因编辑技术CRISPR敲除目的基因后改造其产物糖型，可获得高甘露糖糖型含量的葡萄糖脑苷脂酶，其甘露糖糖型含量远高于现有技术水平，可以更好的与甘露糖受体结合，酶活效力得到提高，该细胞株可作为生产LSD病酶替代疗法所需蛋白酶的工业用稳定细胞株。

本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶及其制备方法，相比现有技术可以有效提高葡萄糖苷酶中甘露糖糖型含量，酶活效力更高，用于酶替代疗法治疗LSD的药效更好。

本发明所要解决的技术问题之三在于，提供一种高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶用于制备治疗LSD药物的应用。

为解决上述技术问题之一，本发明提供一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株的制备方法，该方法包含三部分内容，包括脂质体转染、有限稀释法克隆、目的基因突变克隆筛选。具体包括以下步骤：

(1)脂质体转染：针对GNT1基因的序列，设计引导核酸内切酶切割的sgRNA序列；将所述sgRNA序列重组至敲除载体中，得到sgRNA和核酸内切酶Cas9共表达的合成质粒；通过脂质体转染方法将合成质粒转染稳定表达葡萄萄糖脑苷脂酶的细胞池。