[发明专利]一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)脂质体转染：针对GNT1基因的序列，设计引导核酸内切酶切割的sgRNA序列；将所述sgRNA序列重组至敲除载体中，得到sgRNA和核酸内切酶共表达的合成质粒；通过脂质体转染方法将合成质粒转染稳定表达葡萄糖脑苷脂酶的细胞池；

(2)有限稀释法克隆：通过对转染后细胞群进行有限稀释法克隆，筛选出单克隆细胞进行扩大培养；

(3)目的基因突变克隆筛选：通过对单克隆细胞进行细胞PCR测序，获得GNT1基因敲除单克隆。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸内切酶为核酸内切酶Cas9。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞池为CHO细胞。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述sgRNA序列包括SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示的序列。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，合成质粒通过以下方法得到：

合成编码sgRNA靶向部分的引物，将两条引物退火，获得短的插入片段；

用BbsI核酸内切酶消化敲除载体，获得酶切载体；

将所述插入片段和所述酶切载体用连接酶连接，转化大肠杆菌，获得所述合成质粒。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，转染合成质粒后，孵育的温度为37℃，时间为48-72小时。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用有限稀释法克隆时，铺板密度为0.2cells/well～0.8cells/well。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，使用特定拍照仪器对孔板进行拍照，以保存单克隆证据。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括终克隆扩增及表征鉴定步骤：对GNT1基因敲除单克隆进行至少一轮连续流加实验，测定其上清酶活并对其产物进行纯化，将纯化后的目的产物检测其N端糖型分布，确认其在敲除GNT1后甘露糖糖型含量。

10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法获得的表达高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的细胞株。

11.一种高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶的制备方法，包括以下步骤：

利用权利要求10所述的细胞株表达目标产物，将目标产物纯化得到高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，是通过连续流加实验表达目标产物。

13.一种由权利要求11或12所述制备方法获得的高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶。

14.一种如权利要求13所述的高甘露糖糖型的葡萄糖脑苷脂酶用于制备治疗LSD药物的应用。