[发明专利]一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法

摘要

本发明公开了一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法，所述方法为：将待测菌株经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中，摇床反应液离心，获得上清液；取上清液加入显色反应液中，室温静置显色，在465nm处测吸光值，根据丙酮酸钠标准曲线，获得上清液中丙酮酸钠的含量，进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力，从而筛选出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株；本发明方法，可以直接高通量筛选获得对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突变体，时间从分析一个样品需要20min，缩短到分析近60个样只需1min，所测得的酶活误差控制在3％以内。

主权项

1.一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法，其特征在于所述方法为：(1)转化反应：将待测菌株经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中，在10‑30℃、100‑300rpm摇床反应20‑120min，将反应液离心，获得上清液；所述底物反应液终浓度组成为：邻苯二酚2‑15g/L，丙酮酸钠2‑20g/L，乙酸铵5‑50g/L，亚硫酸钠0.1‑2g/L，EDTA‑2Na 0.1‑2g/L，磷酸吡哆醛0.2‑2mM，pH 7.0‑8.0，溶剂为超纯水；(2)显色反应：取步骤(1)上清液加入显色反应液中，室温静置显色，在465nm处测吸光值，根据丙酮酸钠标准曲线，获得上清液中丙酮酸钠的含量，进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力，从而筛选出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株；所述显色反应液由10‑250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1‑3:5‑10组成；所述标准曲线是在待测菌株检测相同条件下，将底物反应液与含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌转化反应后的上清液进行显色反应，以丙酮酸钠浓度为横坐标，以465nm处吸光值为纵坐标绘制而成。