[发明专利]一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法

摘要

本发明公开了利用水生植物微萍作为生物反应器高效表达鱼类抗弧菌病疫苗的方法,属于基因工程技术领域。它涉及到利用微萍作为生物反应器来高效生产鱼类抗弧菌病疫苗的一种方法。本发明利用自然水体中常见的微萍作为重组蛋白的“生产车间”,采用特异性表达的启动子和信号肽，实现抗弧菌病疫苗蛋白在微萍大量积累,获得目的蛋白稳定表达的转基因株系。转基因微萍可以直接被鱼类食用以达到治病、免疫的效果。微萍作为生物反应器表达鱼类疫苗比其他植物表达体系具有更高的产量和更低的生产成本。此表达体系的建立为后续利用微萍表达其他蛋白疫苗奠定了基础。

主权项

一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法，包括下述步骤：1）诱导微cluster 组织:野生微萍灭菌2‑3钟后，在SH培养基培养，诱导形成由畸形芽融合成集群样的Callus‑like clusters，用于后续基因转化；2）目的基因的扩增：以提取的弧菌DNA作为模版，利用PCR反应获得目的基因，反应体系的引物: LamB‑F : 5′‑ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG‑3，LamB‑R :5′‑TTACCACCAAGCTTCNRC TTG‑3′，获得的PCR产物LamB基因序列为SEQ ID NO.1所示；3） LamB基因与 pGEM‑Teasy vector载体系统连接4）LamB基因基因与植物表达载体连接：通过overlap PCR在LamB基因5’段连接组成型启动子CaMV35S、增强子tcup、和信号肽Pr1b，同时在其3’段连接蛋白质滞留信号 KDEL、蛋白标记MYC和nos终止子；然后将修饰过的LamB基因连接到由相同酶切的双元载体pMYC 9701上，获得植物表达载体pMYC 9701‑LamB，采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌DH5ɑ进行扩增；5）植物表达载体pMYC 9701‑LamB转化根癌农杆菌EHA1056）微萍愈伤组织与农杆菌共培养7）选择与再生培养：将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH再生培养基：0.6% agar+2% sucrose+2mg/L 2,4‑D+2mg/L BA+300mg/L cefo平板上，每周换一次培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时培养两周；继续将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH筛选培养基：0.6% agar+2% sucrose+2mg/L 2,4‑D+2mg/L BA+300mg/L cefo+5mg/L hygromycin平板上,每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时培养筛选两周；再将上述微萍连同滤纸一起转移到固体SH：0.6% agar+2% sucrose+300mg/Lcefo+5mg/L hygromycin平板上,每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时继续培养筛选两周；再转移到SH叶状体诱导固体培养基：0.6% agar+2% sucrose+300mg/L cefo平板上，每周更换一次相同的固体SH培养基，16小时光照，8小时黑暗条件下，21℃培养72小时诱导叶状体，获得转基因微萍植株；8）微萍转化植株的鉴定：从最初的微萍转化植株中提取总基因组DNA,用PCR验证LamB基因的存在，来筛选转化植株；提取微萍转化株系的总RNA，以总RNA为模板，进行RT‑PCR鉴定LamB基因发生转录。