[发明专利]一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法

说明书

本发明公开了利用水生植物微萍作为生物反应器高效表达鱼类抗弧菌病疫苗的方法,属于基因工程技术领域。它涉及到利用微萍作为生物反应器来高效生产鱼类抗弧菌病疫苗的一种方法。本发明利用自然水体中常见的微萍作为重组蛋白的“生产车间”,采用特异性表达的启动子和信号肽，实现抗弧菌病疫苗蛋白在微萍大量积累,获得目的蛋白稳定表达的转基因株系。转基因微萍可以直接被鱼类食用以达到治病、免疫的效果。微萍作为生物反应器表达鱼类疫苗比其他植物表达体系具有更高的产量和更低的生产成本。此表达体系的建立为后续利用微萍表达其他蛋白疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程技术领域，具体涉及一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法。

背景技术：

近年来，我国水产养殖业发展迅猛，随着高密度、集约化、大规模水产养殖业的出现，鱼类疾病频繁爆发。水产养殖向高密度、集约化发展的同时，鱼类病害问题日益突出。其中弧菌病害是危害海水养殖鱼类最严重的细菌病害之一。弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病。弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌，是海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌，该病在全球范围内广泛发生,其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失,还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类大量死亡。近几年来，我国的海水养殖病害情况非常严重。据统计，在我国已发现的几十种海水养殖病害中，以弧菌病对海水养殖造成的损失最大，几乎所有海水养殖鱼类都有感染弧菌，如石斑鱼、真鲷、卵形鲳鲹、眼斑拟石首鱼、军曹鱼等均曾患弧菌病。弧菌病严重发生时，鱼类死亡率高达90％以上，每年直接经济损失达数百亿元，给养殖生产带来巨大的经济损失，严重影响了我国海水养殖业的发展。传统防治细菌性病原菌的方法是向水体中或者鱼类饲料中添加抗生素或者直接注射抗生素等方法，这种方法不仅成本高而且由此也带来一系列问题，包括滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等不良后果。因此，弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。但一直以来缺少相应的疫苗用于防控，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。

研究表明，细菌性致病菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)在维持自身菌体结构及物质转运方面发挥着重要作用。但同时对于宿主来说,病原菌OMPs却是一种重要的保护性抗原，能够有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫。并且,某些OMPs还在多种病原菌间高度保守,可对不同种或同种不同血清型菌株的感染产生交叉保护,从而成为亚单位疫苗最具潜力的免疫抗原候选成分。因此，细菌外膜蛋白可以作为潜在的保护性抗原在鱼类细菌性病害的防治中得到应用。弧菌外膜蛋白免疫鱼类后能刺激鱼类产生特异性免疫反应，使鱼类获得抗病性。

微萍隶属于浮萍科，又称无根萍、芜萍等，是世界上最小的被子植物。大小1-1.5mm，没有根茎叶的分化，仅以叶状体结构生存。叶状体一般为无性繁殖，即“芽殖”，进行有性生殖时，具有1雌蕊和1雄蕊。微萍通常漂浮于水面，有时会形成休眠体沉入水底，在肥力充足温度合适的条件下迅速繁殖，生长最盛时每平方米可有植物体200万个，状似一片绿色的细砂。微萍广布于世界上温带和热带地区。

利用微萍的优势，将微萍经过改造后建立生物反应器生产医药和生物活性物质，可以表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等活性物质和药品。微萍生物反应器与动物细胞生物反应器相比，表达的蛋白含量更高，分离纯化更简便，排除了微生物和动物细胞反应器中病原微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病源微生物的程序，增加了效力，减少了副作用，大大降低了成本。微萍生物反应器制药的产品质量、成本和安全方面已显现出优势，并很快得到科学家和生物制药业的认可。有科学家预测，未来5-10年植物将成为临床治疗或诊断药品的主要生产系统，而微萍凭借自身的特点将在生物反应器制药方面展现独特的应用优势，具有巨大的开发应用前景。