[发明专利]一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法

摘要

本发明公开了一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法，属于医学生物技术领域。本发明在检测miRNA时有两条引物：扩增引物1与miRNA的3’端一半的序列互补，含T7启动子和标签序列；扩增引物2与miRNA的5’端一半的序列相同，含标签序列。在逆转录酶作用下依托miRNA搭桥可实现两条扩增引物的双向延伸，形成一个含有标签序列、miRNA、T7启动子的dsDNA分子。该分子在T7聚合酶的作用下转录出含有标签序列及miRNA的RNA分子，可根据标签分子对其进行定性分析。本方法具有高特异、高灵敏和高通量的特点，为以miRNA作为生物标志物的疾病诊断提供技术可能。

主权项

1.一种miRNA检测方法，其特征在于，包括步骤：（1）扩增引物及稳定序列设计：a. 扩增引物1，命名为oligo1：oligo1有两个部分，3’端与待检测的miRNA一半的序列互补配对，即通过10或11核苷酸长度与miRNA的3’端的半个分子杂交，5’端是T7启动子序列及标签序列ZC1和/或ZC2，可根据标签序列ZC1或ZC2设计捕获探针和检测探针，用于对后续扩增产物的定性检测，标签序列可根据需要进行设计，数量为1‑2条，长度为16~20nt；T7启动子序列是T7 聚合酶识别位点，用于后续的T7聚合酶转录；b. 稳定序列1：为了增加oligo1和待检测的miRNA杂交体的稳定性，引入稳定序列1，其与标签序列ZC1和/或ZC2、T7启动子序列部分互补配对结合；c. 扩增引物2，命名为oligo2：与oligo1特征相似，有两个部分，3’端与待检测的miRNA的5’端序列相同，长度为10或11个核苷酸，与miRNA全长的cDNA序列互补配对结合；5’端含有一个标签序列ZC3，该标签序列可以用于后续扩增产物定性检测时包被探针或检测探针的设计；d. 稳定序列2：为了增加oligo2和新合成的miRNA‑cDNA杂交体的稳定性，引入稳定序列2，其与标签序列ZC3互补配对结合；（2）miRNA检测：a. oligo1和待检测的miRNA 3’端一半的序列结合，形成miRNA‑oligo1复合物，为增加该复合物的稳定性，稳定序列1通过碱基互补配对的原则结合到该复合物上来，最终oligo1、稳定序列1以及miRNA通过融合效应形成一个稳定的oligo1 /miRNA杂合体，该杂合体在逆转录酶的作用下得到含全长miRNA分子cDNA的复合物由此实现miRNA的第一次延伸；b. 以上复合物在RnaseH的作用下，oligo1/miRNA杂合体中的miRNA会被降解，形成oligo1‑miRNA~cDNA；c. oligo2和oligo1‑miRNA‑cDNA互补配对结合，形成oligo2‑ oligo1‑miRNA~cDNA复合物；为增加该复合物的稳定性，稳定序列2通过碱基互补配对的原则结合到该复合物上来，最终Oligo2、稳定序列2、稳定序列1以及oligo1合成的miRNA~cDNA通过融合效应形成一个稳定的杂合体，利用逆转录酶以DNA为模板合成DNA的活性，得到含有T7启动子序列、标签序列以及miRNA分子全长的双链DNA，此为第二次延伸；d.在（c）中形成的双链DNA序列结构为T7 启动子‑‑ZC2‑‑ZC1‑‑miRNA~cDNA‑‑ZC3，该双链DNA可以通过TMA 或 NASBA方法进行RNA扩增，得到序列为ZC2‑‑ZC1‑‑miRNA~cDNA‑‑ZC3的RNA分子；e. 检测所述RNA 的扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测的miRNA的检测结果。