[发明专利]一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法，属于医学生物技术领域。本发明在检测miRNA时有两条引物：扩增引物1与miRNA的3’端一半的序列互补，含T7启动子和标签序列；扩增引物2与miRNA的5’端一半的序列相同，含标签序列。在逆转录酶作用下依托miRNA搭桥可实现两条扩增引物的双向延伸，形成一个含有标签序列、miRNA、T7启动子的dsDNA分子。该分子在T7聚合酶的作用下转录出含有标签序列及miRNA的RNA分子，可根据标签分子对其进行定性分析。本方法具有高特异、高灵敏和高通量的特点，为以miRNA作为生物标志物的疾病诊断提供技术可能。

技术领域

本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的核苷酸片段进行双向延伸检测miRNA的方法及试剂盒。

背景技术

miRNAs在基因表达调控中非常重要，高达30％的哺乳动物的遗传基因的表达都有miRNAs的调控。到目前为止，在人类基因组中已发现超过1000种的miRNAs。成熟的miRNA是一类自然发生的、小的非编码RNA分子，其中许多miRNA分子仅仅只有一个或几个核苷酸的不同。miRNAs的表达具有组织特异性，且丰富度不同，具有几个数量级的差别。更重要的是，miRNA被认为在人类疾病的诊断中是最具潜力的生物标志。

miRNA与普通的RNA相比主要有如下三个特征：(1)miRNAs是很小的分子，约21-25核苷酸长，丰度有相当大的差异；(2)成熟的miRNAs与它们的前体及初前体同时存在；(3)许多miRNAs在序列上高度相关，如它们的不同亚型仅仅只有一个或几个核苷酸的不同。这些独特的性质给常规分析带来挑战，要么需要繁琐的分离miRNA的方法，要么特异性不高，无法将不同亚型区分，或者是检测敏感度低，无法检测低丰度的miRNAs。

由于miRNA太短，约为20核苷酸，无法直接通过常规引物进行扩增。通常需要在miRNAs末端添加一个尾巴，如poly(A)尾，然后再进行扩增。也可通过使用柄状环形引物与miRNA的一部分序列形成互补而进行cDNA延伸。这些方法在引物设计和检测效果上都有一些问题，如引物设计成本高，检测灵敏度不高，无法区分成熟miRNA和前体miRNA(pre-miRNA)等。

针对上述问题，有必要提供一种不仅能特异性的区分待测miRNA与待测miRNA相似的序列、目标miRNA的前体及同时检测多种miRNA，而且简单易行，能快速、高灵敏检测样品中miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高特异、高灵敏和高通量的、可同时检测多种miRNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种miRNA检测方法，包括步骤：

(1)扩增引物及稳定序列设计：

a.扩增引物1(命名为oligo1)：oligo1有两个部分，3’端与待检测的miRNA一半的序列互补配对，即通过10或11核苷酸长度与miRNA的3’端的半个分子杂交，5’端是T7启动子序列及标签序列(命名为ZC1和/或ZC2)，可根据标签序列ZC1或ZC2设计捕获探针和检测探针，用于对后续扩增产物的定性或定量检测，标签序列可根据需要进行设计，数量为1-2条，长度为16～20nt左右；T7启动子序列是T7聚合酶识别位点，用于后续的T7聚合酶转录；

b.稳定序列1：为了增加oligo1和待检测的miRNA杂交体的稳定性，引入稳定序列1，其与标签序列ZC1和/或ZC2、T7启动子序列部分互补配对结合；

c.扩增引物2(命名为oligo2)：与oligo1特征相似，有两个部分，3’端与待检测的miRNA的5’端序列相同(约10或11核苷酸长度)，与miRNA全长的cDNA序列互补配对结合；5’端含有一个标签序列ZC3，该标签序列可以用于后续扩增产物定性检测时包被探针或检测探针的设计；