[发明专利]一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法有效

专利信息
申请号: 201810016415.6 申请日: 2018-01-08
公开(公告)号: CN108103030B 公开(公告)日: 2021-04-30
发明(设计)人: 江兴华;张小兰;阮鹭静;陈丽萍;崔龙萍;朱鸿杰;徐丽云 申请(专利权)人: 兆丰华生物科技(福州)有限公司;兆丰华生物科技(南京)有限公司;北京科牧丰生物制药有限公司;兆丰华生物科技(南京)有限公司北京生物医药科技中心
主分类号: C12N7/00 分类号: C12N7/00;C12N5/071;C12N5/02;C12R1/93
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 350014 福建省*** 国省代码: 福建;35
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摘要: 发明公开了一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法,包括以下步骤:1)转瓶细胞消化,2)细胞过滤,3)细胞接毒上罐培养,4)24h换液,5)收获一收抗原,6)再次消化细胞上罐,7)收获二收抗原并换液培养,8)收获三收抗原,9)将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化,分别过滤去除微载体,得到抗原液并进行效价检测。本发明方法能够提高细胞贴壁效率,减少细胞团块,提高细胞密度,并且能够提高单批抗原收获量,提高抗原效价,降低生产成本。
搜索关键词: 一种 载体 生物反应器 培养 圆环 病毒 方法
【主权项】:
1.一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法,其特征在于:其包括以下步骤:1)转瓶细胞消化:将转瓶PK-15细胞用胰酶消化液消化细胞,将消化后的细胞摇匀;2)细胞过滤:使用10-20微米的细胞过滤器过滤细胞,得到细胞液,取少量过滤后的细胞液用维持液进行4-6倍稀释,然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数,计算出过滤后细胞液的细胞密度;3)细胞接毒上罐培养:将微载体按3-5g/升加入生物反应器中,同时加入7-9倍微载体体积的含血清的营养液,将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的1-5%的量加入细胞液中,然后将细胞液加入生物反应器中,所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体30-50个细胞计算,调节生物反应器中的细胞培养参数,其中,温度为36.5-37.5℃,DO为50-60%,PH为7.2-7.4,搅拌转速为40-60r/min,开启通气系统进行细胞培养;4)24h换液:当生物反应器中细胞培养至24h后,停止加热和搅拌,关闭通气系统,静置3-5分钟,排出细胞培养液,然后加入等量的细胞维持液,开启通气系统,继续在加热和搅拌条件下培养细胞;5)收获一收抗原:当生物反应器中细胞培养至48-52h后,停止加热和搅拌,关闭通气系统,静置3-5分钟,收获上清液,为一收抗原,开启通气系统,继续在加热和搅拌条件下培养细胞,将一收抗原置于-15℃下冷冻保存;6)再次消化细胞上罐:再次将转瓶PK-15细胞按照步骤1)和2)进行转瓶细胞消化和细胞过滤,得到细胞过滤液,然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养,所述细胞过滤液的加入量满足10-20个细胞/个微载体,调节生物反应器中的细胞培养参数,其中,温度为36.5-37.5℃,DO为50-60%,PH为7.2-7.4,搅拌转数为40-50r/min,开启通气系统进行细胞培养,8-10h后将搅拌转数调为50-60 r/min;7)收获二收抗原并换液培养:当生物反应器中细胞培养至96 h后,停止加热和搅拌,关闭通气系统,静置3-5分钟,再次收获上清液,为二收抗原,将二收抗原置于-15℃下冷冻保存,重新加入等量的细胞维持液继续培养,调节生物反应器中的细胞培养参数,其中,温度为36.5-37.5℃,DO为50-60%,PH为7.2-7.4,搅拌转数为50-60r/min,开启通气系统,继续在加热和搅拌条件下培养细胞;8)收获三收抗原:当反应器中细胞培养至120-144h后,调节搅拌转数为100-150r/min,搅拌3-5分钟,停止加热,关闭通气系统,再次收获上清液,为三收抗原,将三收抗原置于-15℃下冷冻保存;9)冻融、过滤收获抗原液:将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化,分别过滤去除微载体,得到抗原液并进行效价检测。
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