[发明专利]富集和确定靶核苷酸序列的方法

摘要

本发明题为富集和确定靶核苷酸序列的方法。本发明提供了用于从包含核酸的样本富集和确定多个靶基因座的核苷酸序列的方法、组合物和试剂盒。所述方法包括一个或多个循环的引物延伸，然后使用巢式靶标特异性引物对靶序列进行PCR扩增的。

主权项

1.一种从包含含有靶核苷酸序列的核酸模板的核酸样本富集具有所关注基因座的所述靶核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)将通用接头连接至所述核酸模板以提供连接的核酸，其中所述通用接头是在第一末端包含双链部分并且在第二末端包含非双链部分的寡核苷酸，并且其中所述核酸模板通过所述第一末端连接到所述通用接头；(b)将所述连接的核酸解离成第一链和第二链，其中所述第一链包含所述靶核苷酸序列；(c)将外部引物退火至所述连接的核酸的第一链中所述靶核苷酸序列附近；(d)使用DNA聚合酶将所述外部引物延伸达到所述连接的核酸的第一链的全长，以提供新生的引物延伸双链体；(e)在足够高的温度下将所述新生的引物延伸双链体解离成所述连接的核酸的第一链和单链引物延伸产物；(f)重复步骤(c)‑(e)进行一个或多个引物延伸循环；(g)在足以对所述靶核苷酸序列进行PCR扩增的条件下，使所述单链引物延伸产物与DNA聚合酶、通用接头引物和内部引物接触，其中所述通用接头引物退火至所述单链引物延伸产物中的所述通用接头的所述非双链部分的互补序列，其中所述内部引物在3'末端包含特异性地退火至所述靶核苷酸序列的序列，并且其中所述内部引物针对所述所关注的基因座相对于所述外部引物是巢式的；以及(h)重复步骤(g)进行一个或多个PCR扩增循环，以提供所述靶核苷酸序列的扩增子，从而富集所述靶核苷酸序列。