[发明专利]富集和确定靶核苷酸序列的方法

说明书

本发明题为富集和确定靶核苷酸序列的方法。本发明提供了用于从包含核酸的样本富集和确定多个靶基因座的核苷酸序列的方法、组合物和试剂盒。所述方法包括一个或多个循环的引物延伸，然后使用巢式靶标特异性引物对靶序列进行PCR扩增的。

技术领域

本发明涉及基因组学领域，具体地讲涉及富集和确定核苷酸序列的方法。

背景技术

下一代测序(NGS)技术在过去的十年里彻底改变了基因组学领域。每次NGS运行通常生成关于每次测序运行的并行数十万到数十亿个DNA模板的数千兆序列信息。目前用于人类基因组测序的成本已经达到1000美元的基准。NGS技术的低成本和高通量使得人们能够使用核酸测序作为临床工具。

然而，要达到NGS临床应用所需的期望成本、速度、分析灵敏度和准确度，仍然存在许多挑战。现今，主要的NGS平台具有相对较短的读段(35-700bp)、较高错误率(～0.1-15％)和平台依赖性偏差。临床样本，诸如活检样本和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本，仅提供了少量的起始材料。罕见的遗传变异可能需要高达100000×的检测覆盖范围。参见例如S.Goodwin等人，Nat.Rev.Genetics，2016年，第17期，第333页。

靶向测序提供了具有适当广度和深度的测序数据，从而允许检测临床相关的遗传变异。该方法的关键步骤是靶标富集，其在测序之前选择性地从核酸样本(诸如基因组DNA样本)中捕获靶区域。各种已知的靶标富集方法，包括基于微滴的PCR、分子倒位探针和杂交捕获方法，都需要大量的输入模板、专门的仪器或诱饵设计，以及偏倚的序列覆盖范围。参见Mamanova等人，Nat.Methods，2010年，第7卷第(2)期，第111页。

本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文中。

发明内容

本发明提供了用于富集和确定核苷酸序列的方法、组合物、试剂盒和分析系统。

本申请的一个方面提供了从包含含有靶核苷酸序列的核酸模板的核酸样本富集具有所关注基因座的靶核苷酸序列的方法，该方法包括：(a)将通用接头连接至核酸模板以提供连接的核酸，其中该通用接头是在第一末端包含双链部分并且在第二末端包含非双链部分的寡核苷酸，并且其中该核酸模板通过第一末端连接到通用接头；(b)将连接的核酸解离成第一链和第二链，其中第一链包含靶核苷酸序列；(c)将外部引物退火至连接的核酸的第一链中靶核苷酸序列附近；(d)使用DNA聚合酶将外部引物延伸达到连接的核酸的第一链的全长，以提供新生引物延伸双链体；(e)在足够高的温度下将新生引物延伸双链体解离成连接的核酸的第一链和单链引物延伸产物；(f)重复步骤(c)-(e)进行一个或多个引物延伸循环；(g)在足以对靶核苷酸序列进行PCR扩增的条件下，使单链引物延伸产物与DNA聚合酶、通用接头引物和内部引物接触，其中所述通用接头引物退火至单链引物延伸产物中的通用接头的非双链部分的互补序列，其中所述内部引物在3'末端包含特异性地退火至靶核苷酸序列的序列，并且其中所述内部引物针对所关注的基因座相对于外部引物是巢式的；以及(h)重复步骤(g)进行一个或多个PCR扩增循环，以提供靶核苷酸序列的扩增子，从而富集靶核苷酸序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列的扩增子用于下一代测序(NGS)。

在根据上述任一方法所述的一些实施方案中，该方法包括使用可特异性地退火至连接的核酸的第一链的第一组外部引物和内部引物，以及可特异性地退火至连接的核酸的第二链的第二组外部引物和内部引物，来富集具有所关注基因座的靶核苷酸序列。在一些实施方案中，第一组的外部引物和第二组的外部引物包含至少约13个核苷酸长的第一5'标签序列，并且其中第一组的内部引物和第二组的内部引物包含至少约13个核苷酸长的第二5'标签序列。在一些实施方案中，第一5'标签序列的GC含量与核酸模板的GC含量基本上相似。