[发明专利]携带嵌合抗原受体的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体是一种利用分离获得携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用。具体是将CAR免疫细胞以特异性的抗原活化后，产生的外泌体进行进一步的分析、分离、纯化、富集，最终得到携带CAR的免疫细胞外泌体。本发明制备的外泌体能用于各种疾病的治疗，如癌症，重型传染病等，且这种外泌体具克服CAR细胞治疗的免疫炎症风暴等不良反应，增强了CAR的组织浸透能力，还具有保存和运输方便的优势，为相关疾病的治疗提供了新的策略。

主权项

1.一种携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A)制备CAR免疫细胞：按照通用的生物工程手段制备CAR免疫细胞；B)对CAR免疫细胞进行抗原特异性活化：采用的活化剂是特异性靶点的可溶性重组蛋白、表达特异性靶点的工程细胞、或直接使用表达特异性靶点肿瘤细胞；所述的特异性靶点指的是CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点，即CAR免疫细胞靶向的特异性靶点；活化的方法为在体外的培养体系中加入抗原蛋白或固化的抗原蛋白、直接共培育CAR免疫细胞及和表达特异性靶点的灭活后工程细胞、直接共培育CAR免疫细胞和表达特异性靶点的灭活后肿瘤细胞；C)收集制备CAR免疫细胞外泌体：采集培养上清，按照通用的外泌体分离方法进行收集制备；D)CAR外泌体的纯化和富集：向步骤C中制得的外泌体重悬液中加入特异性抗原包被的磁性体，即CAR捕获磁体，所述磁性体上含有与CAR蛋白特异性结合的重组靶点蛋白抗原；孵育后将重悬液置于磁场中，除去上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体；将上清液加入分选柱后，先流出的是无抗原结合能力的外泌体，然后采用缓冲液洗脱分选柱，流出的即为具有抗原结合能力、携带CAR的免疫细胞外泌体；根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入PBS重悬，用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度，‑80℃分装保存。