[发明专利]携带嵌合抗原受体的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及生物医药领域，具体是一种利用分离获得携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用。具体是将CAR免疫细胞以特异性的抗原活化后，产生的外泌体进行进一步的分析、分离、纯化、富集，最终得到携带CAR的免疫细胞外泌体。本发明制备的外泌体能用于各种疾病的治疗，如癌症，重型传染病等，且这种外泌体具克服CAR细胞治疗的免疫炎症风暴等不良反应，增强了CAR的组织浸透能力，还具有保存和运输方便的优势，为相关疾病的治疗提供了新的策略。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种利用分离获得含嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)外泌体的制备方法及其治疗疾病的应用。

背景技术

以手术治疗、放射治疗及化学治疗为主，辅以新型的靶向治疗方案是近年来对恶性肿瘤治疗的基本策略，且已经在临床实践中取得重要的进展。但恶性肿瘤的复发、转移和治疗性耐受依然是一直困扰临床和科研工作者的难题。近年来，基因修饰各种免疫细胞用于治疗疾病的方法已经提出，如通过嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)在T细胞上的表达，使得基因修饰的T细胞靶向肿瘤细胞上表达的抗原，以治疗癌症类疾病。这类的治疗方式已经获得一定程度上的成功，第一个类似的产品也与2017年或FDA批准(Brentjens R,et al.Treatment of chronic lymphocytic leukemia with geneticallytargeted autologous T cells:case report of an unforeseen adverse event in aphase I clinical trial，Molecular Therapy,2010,18(4):666-668.)随着目前技术的发展，目前嵌合抗原受体细胞技术中嵌合抗原受体基因构建的方式主要划分以下三代。第一代CAR的基因工程技术由胞外结合区-单链抗体(Single-chain fragment variable，scFv)、跨膜区(Transmembrane Region，TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immuno-receptor tyrosine-based activation motif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体CAR部分按照如下形式连接：svFv-TM-CD3ζ(Zhang T,Barber A,Sentman C L.ChimericNKG2D–Modified T Cells Inhibit Systemic T-Cell Lymphoma Growth in a MannerInvolving Multiple Cytokines and Cytotoxic Pathways[J].Cancer research,2007,67(22):11029-11036.)。随后发展的第二代CAR基因工程策略在一代的基础上增加了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按照如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T细胞等免疫细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2等细胞因子的水平(Savoldo B,et al.CD28 costimulation improves expansion and persistence ofchimeric antigen receptor–modified T cells in lymphoma patients.The Journalof clinical investigation,2011,121(5):1822.)。近年来发展的第三代CAR基因工程连接如下：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-28-CD134-ITAM，进一步提高CAR-T在体内的存活周期和效果(Carpenito C,et al.Control of large,established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28andCD137domains.Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(9):3360-3365.)。除了最常用的T细胞，近年来也涌现出利用CAR技术制备其他免疫细胞类型的治疗方法，如CAR-NK[Chu J,et al.CS1-specific chimeric antigen receptor(CAR)-engineered natural killer cells enhance in vitro and in vivo antitumoractivity against human multiple myeloma.Leukemia,2014,28(4):917-927.]等。