[发明专利]携带嵌合抗原受体的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)制备CAR免疫细胞：

B)对CAR免疫细胞进行抗原特异性活化：

采用的活化剂是特异性靶点的可溶性重组蛋白、表达特异性靶点的工程细胞或表达特异性靶点的肿瘤细胞；所述的特异性靶点指的是CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点，即CAR免疫细胞靶向的特异性靶点；活化的方法为在体外的培养体系中加入抗原蛋白或固化的抗原蛋白、直接共培育CAR免疫细胞和表达特异性靶点的灭活后工程细胞、直接共培育CAR免疫细胞和表达特异性靶点的灭活后肿瘤细胞；

C)收集制备CAR免疫细胞外泌体：

采集培养上清，收集制备CAR免疫细胞外泌体；

D)CAR外泌体的纯化和富集：

向步骤C中制得的外泌体重悬液中加入特异性抗原包被的磁性体，即CAR捕获磁体，所述磁性体上含有与CAR蛋白特异性结合的重组靶点蛋白抗原；孵育后将重悬液置于磁场中，除去上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体；将上清液加入分选柱后，先流出的是无抗原结合能力的外泌体，然后采用缓冲液洗脱分选柱，流出的即为具有抗原结合能力、携带CAR的免疫细胞外泌体；根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入PBS重悬，用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度，-80℃分装保存。

2.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤A的免疫细胞是T细胞或NK细胞；所述的免疫细胞的来源是患者自身或健康志愿者。

3.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤A的免疫细胞为健康志愿者来源的T细胞，CAR免疫细胞的制备方法按照以下步骤实施：

(a)获得细胞样本并分离和激活，所述样本为T细胞或T细胞的祖细胞；

(b)构建scFv-CD8hinge and TM-4-1BB-CD3、scFv-hinge-TM-CD28-CD3、scFv-hinge-CD28-4-1BB-CD3的病毒载体；

(c)制作重组质粒并包装病毒；

(d)病毒感染T细胞；

(e)体外培养扩增CAR-T细胞群体。

4.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点是EGFR，HER2或CD20。

5.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤B采用的活化剂为表皮生长因子EGFR胞外段重组蛋白、磁珠交联的EGFR胞外段重组蛋白、表达EGFR的CHO细胞、表达EGFR的MDA-MB-231细胞、磁珠交联的HER2胞外段重组蛋白、表达HER2的BT474细胞或表达CD20的Raji细胞。

6.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤C收集制备CAR免疫细胞外泌体的方法为：将收集的培养上清于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃，110000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加PBS清洗一次，于4℃，110000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。

7.一种采用如权利要求1-6任一所述的制备方法制备得到的携带CAR的免疫细胞外泌体，所述的外泌体携带CAR蛋白，平均直径在30-150nm。

8.一种如权利要求7所述的携带CAR的免疫细胞外泌体及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.一种制剂，所述的制剂为包含如权利要求7所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的组合物。