[发明专利]一种体外活化扩增自然杀伤细胞的方法

摘要

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种NK细胞的体外活化扩增培养方法。在激活剂预处理中，是在培养瓶中加入激活剂和PBS进行混合后，所述激活剂含有0.10mg‑100.00mg/ml的透明质酸和0.1μg‑20μg/ml的CD16抗体，激活剂和PBS的体积比为1:40；活化处理，吸除激活剂，然后加入生理盐水，轻晃培养瓶，最后吸除生理盐水,得到已包被的培养瓶。在培养单个核细胞时向培养基中添加GM‑CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，使其终浓度在0.05μg‑1.00μg/ml之间。相比于已有的专利方法，更为简单有效，有效地降低了NK细胞的体外扩增培养成本。在包被步骤中，加入透明质酸，显著地增加NK细胞的比例和扩增倍数；具有极大的市场前景和经济价值。

主权项

1.一种体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A.激活剂预处理在培养瓶中加入激活剂和PBS进行混合后，所述激活剂含有0.10mg‑100.00mg/ml的透明质酸和0.1μg‑20μg/ml的CD16抗体，所述激活剂和所述PBS的体积比为1:40，活化处理，吸除激活剂，然后加入生理盐水，轻晃培养瓶，最后吸除生理盐水，得到已包被的培养瓶；B.单个核细胞分离、血浆采集及处理采集人脐带血或者外周血中的NK细胞，进行密度梯度离心处理，收集上层血浆后进行补体的灭活处理，然后再次离心处理去除血小板，得到待处理的血浆，然后从中收取单个的核细胞层，离心洗涤，然后加入含有GM‑CSF，IL‑15、IL‑2和自体血浆的NK细胞无血清培养基，制得细胞悬浮液，然后取少量细胞悬液计细胞数；C.细胞培养取A步骤后得到的已包被的培养瓶，加入单个核细胞悬液，所述GM‑CSF、IL‑15，IL‑2和自体血浆在所述悬液中的浓度分别为0.05μg‑1.00μg/ml，25‑50ng/ml，500‑1000U/ml和5‑10％；然后进行14‑18天的培养，在这个过程中，及时补充含自体血浆、IL‑2和IL‑15的新鲜培养基，最后得到待处理的细胞；具体步骤如下：1)单个核细胞悬液中加入GM‑CSF、IL‑15，IL‑2和自体血浆，使其终浓度分别为0.05μg‑1.00μg/ml，25‑50ng/ml，500‑1000U/ml和5‑10％，使得悬液中细胞的最终浓度为2*10^6/ml；2)37℃，5％CO2和100％湿度下培养；次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养48小时；3)72小时后，根据细胞密度，加入适量含IL‑21000U/ml，IL‑1550ng/ml，血浆10％的扩增培养基，补充液体量为原体积的一倍；4)继续培养2天，培养液中补充适量含血浆5‑10％，1000U/ml的IL‑2和50ng/ml的IL‑15的新鲜扩增培养基，补液量一般为原体积的1‑3倍；5)每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆、IL‑2和IL‑15的新鲜培养基；6)继续培养1‑3天，此时应转大培养袋培养；补充适量含10％血浆，IL‑2和IL‑15，使得悬液中IL‑2和IL‑15的最终浓度分别为500‑1000U/ml和25‑50ng/ml；7)每隔2‑3天补充新鲜的含血浆及细胞因子的培养基，再继续培养7‑11天细胞，达到目的用量后，收获细胞；D.细胞收获将细胞转移到离心管，进行离心处理，再用生理盐水离心洗涤，然后加入注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞，进行细胞过滤处理，然后静置得到扩增后的细胞悬液。