[发明专利]一种体外活化扩增自然杀伤细胞的方法

权利要求书

1.一种体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A.激活剂预处理

在培养瓶中加入激活剂和PBS进行混合后，所述激活剂含有0.10mg-100.00mg/ml的透明质酸和0.1μg-20μg/ml的CD16抗体，所述激活剂和所述PBS的体积比为1:40，活化处理，吸除激活剂，然后加入生理盐水，轻晃培养瓶，最后吸除生理盐水，得到已包被的培养瓶；

B.单个核细胞分离、血浆采集及处理

采集人脐带血或者外周血中的NK细胞，进行密度梯度离心处理，收集上层血浆后进行补体的灭活处理，然后再次离心处理去除血小板，得到待处理的血浆，然后从中收取单个的核细胞层，离心洗涤，然后加入含有GM-CSF，IL-15、IL-2和自体血浆的NK细胞无血清培养基，制得细胞悬浮液，然后取少量细胞悬液计细胞数；

C.细胞培养

取A步骤后得到的已包被的培养瓶，加入单个核细胞悬液，所述GM-CSF、IL-15，IL-2和自体血浆在所述悬液中的浓度分别为0.05μg-1.00μg/ml，25-50ng/ml，500-1000U/ml和5-10％；然后进行14-18天的培养，在这个过程中，及时补充含自体血浆、IL-2和IL-15的新鲜培养基，最后得到待处理的细胞；

具体步骤如下：

1)单个核细胞悬液中加入GM-CSF、IL-15，IL-2和自体血浆，使其终浓度分别为0.05μg-1.00μg/ml，25-50ng/ml，500-1000U/ml和5-10％，使得悬液中细胞的最终浓度为2*10^6/ml；

2)37℃，5％CO2和100％湿度下培养；次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养48小时；

3)72小时后，根据细胞密度，加入适量含IL-21000U/ml，IL-1550ng/ml，血浆10％的扩增培养基，补充液体量为原体积的一倍；

4)继续培养2天，培养液中补充适量含血浆5-10％，1000U/ml的IL-2和50ng/ml的IL-15的新鲜扩增培养基，补液量一般为原体积的1-3倍；

5)每天观察细胞集落大小及细胞密度，及时补充含血浆、IL-2和IL-15的新鲜培养基；

6)继续培养1-3天，此时应转大培养袋培养；补充适量含10％血浆，IL-2和IL-15，使得悬液中IL-2和IL-15的最终浓度分别为500-1000U/ml和25-50ng/ml；

7)每隔2-3天补充新鲜的含血浆及细胞因子的培养基，再继续培养7-11天细胞，达到目的用量后，收获细胞；

D.细胞收获

将细胞转移到离心管，进行离心处理，再用生理盐水离心洗涤，然后加入注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞，进行细胞过滤处理，然后静置得到扩增后的细胞悬液。

2.如权利要求1所述的体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述A步骤中，活化处理放置的条件为4℃下活化12-16小时；或置于4℃冰箱保存，时长2周。

3.如权利要求2所述的体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述B步骤中所述密度梯度离心处理为2000rpm，时间为25分钟；所述灭活处理除去补体后的温度为56℃，时间持续20分钟；所述灭活处理的离心处理速度为3000rpm，时间不小于5分钟；灭活离心处理除去补体后还需要将去除血小板后的血浆置于4℃储存备用。

4.如权利要求3所述的体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤B中，离心洗涤的次数为两次，时间为6分钟。

5.如权利要求4所述的体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述D步骤中，离心处理的次数为两次，速度为1500rpm，离心时间为6分钟。

6.如权利要求5所述的体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述D步骤中，所述注射用人白蛋白的生理盐水悬浮细胞的浓度为1％。

7.如权利要求6所述的体外活化扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述D步骤中，所述细胞过滤处理用的筛子为70μm的细胞筛。