[发明专利]一种体外活化扩增自然杀伤细胞的方法

说明书

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种NK细胞的体外活化扩增培养方法。在激活剂预处理中，是在培养瓶中加入激活剂和PBS进行混合后，所述激活剂含有0.10mg‑100.00mg/ml的透明质酸和0.1μg‑20μg/ml的CD16抗体，激活剂和PBS的体积比为1:40；活化处理，吸除激活剂，然后加入生理盐水，轻晃培养瓶，最后吸除生理盐水,得到已包被的培养瓶。在培养单个核细胞时向培养基中添加GM‑CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，使其终浓度在0.05μg‑1.00μg/ml之间。相比于已有的专利方法，更为简单有效，有效地降低了NK细胞的体外扩增培养成本。在包被步骤中，加入透明质酸，显著地增加NK细胞的比例和扩增倍数；具有极大的市场前景和经济价值。

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种自然杀伤细胞(NK细胞)的体外培养扩增方法。

背景技术

通常，NK细胞的应用工艺流程，从不同来源的血液采集开始，经历了血液(如外周血、脐带血、骨髓)的单个核细胞分离、种瓶包被、激活剂刺激、特异性抗体诱导、大规模扩增培养、NK细胞收获、质量监控等七个阶段，涉及单个核细胞的分离技术、NK细胞的体外诱导和激活技术、NK细胞的体外高效扩增技术、NK细胞的收获技术、NK细胞的质量控制技术等关键工艺技术。其中，NK细胞的体外诱导和大规模高效扩增技术是整个NK细胞制备工艺的基础和关键步骤，很大程度地决定了最终所得NK细胞产品的最终数量、纯度和杀伤活性。特别地，如果经体外培养得到的NK细胞的纯度较低、含有CD3+阳性的非NK淋巴细胞较多，会严重地降低NK细胞的直接杀伤活性及其抗衰老等功效并容易引起主要由T淋巴细胞导致的严重的副作用，如高烧、过敏等；此外，如果NK细胞体外培养的数量较少，那么则会大大地增加NK细胞的应用成本。

因此，NK细胞的体外高效活化及扩增技术一直都是本领域的研究热点。目前，从人外周血中分离人NK细胞的基本方法是：首先，对所获得的血液样品进行密度梯度离心，取得白膜层(内含单个核细胞PBMC)；然后，使用0.9％生理盐水将血样标本还原至原体积，离心、洗涤，并用无血清培养基将PBMC重悬，调整细胞浓度至适当范围；接下来，将PBMC重悬液转入预先包被好的细胞培养瓶中刺激、培养适当时间；最后，转入细胞培养袋中继续培养，持续添加含有活性成分的无血清培养基，维持细胞浓度在合适范围，14天左右后即可得到大量扩增的NK细胞。以上现有技术存在多方面的不足，包括：1)NK细胞的扩增倍数较低，经过两个星期左右的培养，NK细胞的扩增倍数仅为几倍至十几倍；2)所得NK细胞的纯度较低，达不到实际应用的要求；3)在培养过程中，大量使用多种价格高昂的细胞因子和抗体，造成NK细胞的制备成本过高，不适合进行NK细胞的大规模体外培养扩增；4)虽然有研究者将K562细胞作为滋养层细胞来培养NK细胞，并获得了纯度较高、数量较多的NK细胞。但是K562细胞是一种白血病细胞，可以释放大量的含有肿瘤核酸信息的外泌体微囊促使正常的造血细胞恶变，用滋养层细胞培养制备的NK细胞用于临床治疗存在着较高的安全风险，对制备工艺的要求也异常苛刻。故一般不推荐作为临床级NK细胞大规模培养的常规技术。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，经过大量的诱导激活剂筛选等实验研究，尤其是NK细胞的体外活化培养、扩增技术进行了优化，从而找到的一种操作简便而经济有效的NK细胞培养扩增技术，具NK细胞得率高、生长状态好、杀伤活性高、整体工艺成本低特点。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种体外高效活化扩增NK细胞的方法，所方法包括如下步骤：

A.激活剂预处理

在培养瓶中加入激活剂和PBS进行混合后，所述激活剂含有0.10mg-100.00mg/ml的透明质酸和0.1μg-20μg/ml的CD16抗体，所述激活剂和所述PBS的体积比为1:40；活化处理，吸除激活剂，然后加入生理盐水，轻晃培养瓶，最后吸除生理盐水,得到已包被的培养瓶；

B.单个核细胞分离、血浆采集及处理